基于生物網絡功能模塊整合組方規律分析四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的作用機制

周煒煒,王雪峰,張夢潔,楊 娟,孫悅龍,張祖烽,張宇欣,豆佳紅,王梓穎,戴小楓*,李秀梅*

(1.中國農業科學院飼料研究所 農業農村部飼料生物技術重點實驗室,北京 100081;2.哈爾濱商業大學藥學院,哈爾濱 150076;3.天津科技大學生物工程學院,天津 300457)

仔豬腹瀉作為養殖業中常見的仔豬疾病之一,病因復雜多樣,主要包括傳染性因素(病毒、細菌、寄生蟲等)及非傳染性因素(仔豬自身免疫不足、斷奶應激、飼養環境等)[1]。它可引起仔豬食欲下降、生產性能下降,甚至導致較高病死率。目前常采用抗生素等藥物治療方法,雖成本低、見效快,但易產生較高耐藥性,且復發率高。中獸醫理論認為,仔豬腹瀉是因體虛、正氣不足及濕熱等外邪侵入體內所致。為達到“標本兼治、扶正祛邪”的目的,部分中藥復方已被廣泛應用于預防和治療仔豬腹瀉[2-5]。其中,四黃止痢顆粒因治療雞、豬的濕熱瀉痢效果顯著而逐漸受到關注。

四黃止痢顆粒是由黃連、黃柏、大黃、黃芩、板藍根、甘草6味中藥組成的中藥成方制劑,收錄于2020年版《中華人民共和國獸藥典》[6]。四黃止痢顆粒具有清熱瀉火、止痢的功效,臨床上多用于治療濕熱引起的雞、豬瀉痢以及細菌、病毒引起的熱性疾病[7-8]。雖療效顯著,但其藥味組成較多、配伍關系復雜,其相關功效物質基礎及作用機制尚未闡明,且多數研究僅限于單一成分、單一靶點,缺少從系統網絡水平來探索其配伍關系及作用機制方面的內容,限制了其臨床應用。

網絡藥理學是一種以藥物與疾病的相互作用為基礎,通過網絡分析闡明中藥復方作用機制的新方法[9]。生物網絡功能模塊的識別和特征分析可在一定程度上簡化網絡結構,揭示其關鍵環節和核心機制[10]。MCODE(molecular complex detection)作為一種非交疊式聚類算法,最初用于檢測蛋白相互作用網絡中的蛋白質復合物,目前主要用于檢測蛋白相互作用網絡中緊密連接的區域,即功能模塊的識別[11]。因此,本研究嘗試在網絡藥理學的基礎上,參考“模塊藥理學”的研究思路[12-13],使用MCODE聚類算法對復雜網絡進行分解和解構,篩選獲得藥物特異性高、疾病針對性強的網絡(功能模塊),再對其進行通路富集與比較分析以及歸經分析,從而全面揭示中藥方劑的功效物質和作用機理。

本研究依據中獸醫理論,嘗試從“中藥靶點-疾病靶點-生物通路-功能模塊”多個層次進行關聯網絡分析,多維度揭示四黃止痢顆粒的作用機制,闡釋其君臣佐使配伍規律,明確各單味藥在復方發揮整體藥效過程中的貢獻,從而為新中獸藥復方的發現以及應用提供參考[14]。

1 材料與方法

1.1 四黃止痢顆粒的組方理論

方中黃連藥性苦、寒,歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經,善于清中焦脾胃的濕熱,為君藥。黃柏歸腎、膀胱經,善于清下焦濕熱;黃芩歸肺、膽、脾、大腸、小腸經,善于清上焦濕熱。黃柏、黃芩藥性苦、寒,二者配合可清上下焦濕熱,為臣藥,與黃連配伍加強清熱燥濕,瀉火解毒之效。大黃藥性苦寒,善于瀉下胃腸濕熱;板藍根有清熱涼血的功效。大黃、板藍根二者均能瀉熱,共為佐藥。方中甘草調和諸藥、緩急和中,為使藥。諸藥合用,共奏清熱燥濕,涼血止痢之功。

1.2 四黃止痢顆粒活性成分的收集及藥物靶點的預測

通過檢索TCMSP(https://tcmsp-e.com/)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、HERB(http://herb.ac.cn/)數據庫收集四黃止痢顆粒(黃柏、黃芩、黃連、大黃、板藍根、甘草)的成分,利用口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%及類藥性(drug-like index, DL)≥0.18作為篩選條件獲得四黃止痢顆粒的潛在活性成分,同時篩選每個活性成分的對應靶點。

1.3 仔豬腹瀉疾病相關基因與藥物相關基因的差異分析

以“piglet diarrhea”為關鍵詞分別檢索GeneCards、NCBI、OMIM數據庫獲取豬腹瀉的相關靶點基因,去冗余后得到仔豬腹瀉的潛在疾病靶點。使用Venny 2.1軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取四黃止痢顆粒的藥物靶點和豬腹瀉相關疾病靶點的交集,比較四黃止痢顆粒中6味中藥的藥物相關基因與仔豬腹瀉疾病相關基因間的異同,分析二者的重疊基因和差異基因。

1.4 靶點蛋白相互作用網絡(protein-protein interaction network, PPI)的構建及功能模塊的識別

將上述重疊基因導入UniProt(https://www.uniprot.org)數據庫獲得物種為“PIG”的標準蛋白名,上傳至STRING數據庫(https://string-db.org/)構建PPI網絡圖,設置物種為“Susscrofa”,置信度≥0.04;運用Cytoscape 3.5.1軟件構建四黃止痢顆粒的藥物靶點-仔豬腹瀉靶點的蛋白相互作用網絡圖。

1.5 模塊的功能富集分析

應用MCODE插件對上述PPI網絡進行功能模塊識別。MCODE聚類算法主要通過頂點加權的方式生成聚類,包括3個步驟:1)基于局部網絡密度的節點賦權重;2)模塊預測;3)后期處理操作。應用David數據庫進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析,探討四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的關鍵靶點和相關信號通路。

2 結 果

2.1 四黃止痢顆粒中活性成分的檢索及靶點預測

由表1可知,通過檢索TCMSP、TCMID、HERB數據庫共獲得活性成分180個。其中黃連活性成分10個(生物堿類8個、黃酮類1個、苷類1個),黃柏活性成分21個(生物堿類12個、黃酮類1個,苷類2個、其它6個),黃芩活性成分30個(生物堿類2個、黃酮類21個、苷類1個、其它6個),大黃活性成分9個(蒽醌類2個、黃酮類1個、苷類3個、其它3個),板藍根活性成分27個(生物堿類2個、酮類4個、其它21個),甘草活性成分83個(黃酮類51個、其它32個)。由圖1可知,除佐藥含有蒽醌類代表性成分外,君、臣、佐藥均含有生物堿、黃酮及苷類成分。通過檢索GeneCards、NCBI以及OMIM數據庫篩選獲得四黃止痢顆粒的藥物靶點共88個。

圖1 君臣佐使藥的主要活性成分Fig.1 Main active ingredients of traditional Chinese medicine named monarch, minister, assistant and guide medicines

表1 四黃止痢顆粒的主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Sihuang Zhili granules

2.2 仔豬腹瀉疾病相關基因與藥物相關基因的差異分析

由表2及圖2可知,利用GeneCards、NCBI、OMIM數據庫獲取豬腹瀉相關靶點并去重后得到470個,與四黃止痢顆粒藥物靶點求交集得到35個。其中,君藥、臣藥、使藥均能調控BCL2L1、CASP3、CAV1等28個靶點;佐藥調控EDN1、HP、NR3C1及UCP2等17個靶點。另外,臣藥還能調控靶點CYCS、NR3C1;使藥能調控靶點HMGCR及SLPI。

圖2 四黃止痢顆粒與仔豬腹瀉交集靶點的Venny圖Fig.2 Venny diagram of the intersection targets between Sihuang Zhili granules and piglet diarrhea

表2 四黃止痢顆粒的關鍵靶點Table 2 Key targets of Sihuang Zhili granules

2.3 靶點蛋白PPI網絡的構建及功能模塊的識別

由圖3可知,靶點蛋白PPI網絡包含33個節點、175條邊。MCODE 算法是根據復合物中每個蛋白的平均連接數量(即 MCODE 評分,MCODE 評分=密度×節點數)對模塊進行排序。MCODE算法在該PPI網絡圖中共識別1個模塊(節點數>3),包含17個節點(CASP3、EDN1、IL1B、IL1A、SERPINE1、CRP、NOS2、NOS3、SELE、BCL2L1、IFNG、TNF、NFKBIA、FOS、HMOX1、IL10、IL6)和103條邊,評分12.875。

圓形代表關鍵靶點(紅色代表模塊1的靶點),灰色線條代表相互作用關系The circle represents the key target (red represents the target of module 1), and the gray line represents the interaction relationship圖3 四黃止痢顆粒治療豬腹瀉的PPI網絡圖及其功能模塊Fig.3 The PPI network and functional module of Sihuang Zhili granules for treatment of piglet diarrhea

比較君、臣、佐、使藥作用的關鍵靶點和模塊1包含的靶點發現,除EDNI外,模塊1中16個蛋白與君、臣藥作用的靶點存在交集,占比94%(16/17);7個蛋白與佐藥作用的靶點存在交集,占比41%(7/17)。可見,君、臣、使藥作用的靶點基本包含模塊1的整個模塊,進一步確定模塊1屬于整個復方的功能模塊,即發揮功效的關鍵靶點的集合。

2.4 功能富集分析及比較

由圖4可知,四黃止痢顆粒中君藥的作用靶點主要涉及IL-17、TNF、Inflammatory bowel disease等26個信號通路;臣藥主要涉及IL-17、Salmonella infection、TNF等26個信號通路;佐藥主要涉及IL-17、Estrogen、HIF-1等13個信號通路,使藥主要涉及IL-17、TNF、Inflammatory bowel disease等26個信號通路;模塊1主要涉及TNF、IL-17、HIF-1、NF-κB等17個信號通路。整個復方中君、臣、使藥作用的主要信號通路基本一致;相較于君、臣、使藥,佐藥作用的通路數量減少,但均包含于它們作用的26個信號通路中;模塊1作用的通路數量較佐藥多,同樣包含于它們作用的26個信號通路中。

2.5 四黃止痢顆粒歸經分析

由圖5可知,君藥黃連歸脾、胃、大腸、心、膽、肝經;臣藥黃芩歸脾、大腸、膽、肺、小腸經,黃柏歸腎、膀胱經;佐藥大黃歸脾、胃、大腸、肝、心包經,板藍根歸胃、心經;使藥甘草歸脾、胃、心、肺經。整個復方覆蓋了動物機體的11個臟腑經絡,且主要歸脾、胃經,其次是大腸、心、肝、膽、肺、小腸、腎、膀胱和心包經。

藍色橢圓形代表臟腑經絡,橙色長方形代表藥物,線條代表藥物對臟腑經絡有調控作用(黃色線條代表君藥對脾、胃、大腸、心、膽、肝經存在調控作用)The blue oval represents collateral channel of internal organ, the orange rectangle represents medicine, and the line represents the regulatory effect of medicine on collateral channel of internal organ (The yellow line represents the regulatory effect of monarch medicine on the spleen, stomach, large intestine, heart, gall bladder and liver meridians)圖5 四黃止痢顆粒的歸經分析Fig.5 The analysis of channel tropism of Sihuang Zhili granules

3 討 論

3.1 四黃止痢顆粒的主要功效物質基礎

《素問·至真要大論》:“主病之謂君,佐君之謂臣,應臣之謂使”。組成方劑的藥物可按其在方劑中所起的作用分為君、臣、佐、使藥。君指方劑中針對主證起主要治療作用的藥物;臣指輔助君藥治療主證,或主要治療兼證的藥物;佐指配合君臣藥治療兼證,或抑制君臣藥的毒性,或起反佐作用的藥物;使指引導諸藥直達病變部位,或調和諸藥的藥物。

本研究通過網絡藥理學篩選發現,黃連、黃柏、板藍根的功效物質為生物堿及苷類成分,黃芩、甘草的功效物質為黃酮及苷類成分,大黃的功效物質為蒽醌及苷類成分;比較分析四黃止痢顆粒中君(黃連)、臣(黃柏、黃芩)、佐(大黃、板藍根)、使(甘草)藥的成分后發現,除佐藥含有蒽醌類代表性成分外,君、臣、佐藥均含有生物堿、黃酮、苷類成分。現代藥理學研究發現,黃連主要含有生物堿類成分,可減弱特異性免疫功能,同時具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用。黃連總生物堿中小檗堿含量最高,達10%,其次是巴馬汀、黃連堿、小檗紅堿等,均具有顯著的藥理活性[15]。其中小檗堿可通過抑制細菌內毒素、細菌表面蛋白排序酶活性[16]以及逆轉大腸桿菌相關毒素的分泌[17]、調節腸道運動[18]、改善腸屏障功能治療各種細菌相關性腹瀉[19]。黃連堿、巴馬汀可抑制大腸桿菌、腸炎沙門菌、金黃色葡萄球菌等的活性[20],且黃連堿具有保護胃黏膜的作用[21]。小檗紅堿作為小檗堿的主要代謝物之一,其抗炎、抗真菌效果顯著[22-23]。黃柏主要含有生物堿、黃酮類成分,其中小檗堿不僅含量高達6%,且抗炎效果顯著[24-26]。黃芩的主要成分為黃酮及其苷類成分,達130余種,具有顯著的抗菌、抗病毒、抗炎及增強免疫功能的作用。其中黃芩苷、黃芩素可通過直接調節線粒體的凋亡途徑,加速活化B、T細胞的凋亡發揮抗炎作用[27-28]。大黃的主要活性成分是蒽醌類,含量達3%～5%,共分離得到34種,其中蘆薈大黃素、大黃素可通過抑制MAPK、核轉錄因子-κB和胞內磷脂酰肌醇-3激酶途徑抑制脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞中炎癥因子的產生,從而發揮抗炎作用;大黃酸可通過影響Toll樣受體5 (TLR5)/NF-κB信號通路, 減少炎癥因子的分泌和淋巴細胞的浸潤, 從而緩解小鼠潰瘍性結腸炎[29-30]。板藍根作為預防和治療流感病毒的代表藥,已有200余種化學成分被分離和鑒定,其中生物堿類成分具有抗炎、抗病毒、解熱等藥理作用;黃酮類成分具有較強的抗病毒作用[31-32]。甘草作為臨床常用配伍藥材,共分離得到300余種黃酮類化合物。甘草總黃酮可通過抑制ERK/MAPK、NF-κB通路及活化PPAR-γ通路,抑制炎癥因子的表達從而發揮抗炎效果,其中有14種黃酮化合物能清除羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫、單線態氧以達到抗氧化的目的[33]。

綜合以往的研究發現,6味藥中生物堿、黃酮、蒽醌、苷類成分不僅含量豐富,且具有顯著的藥理活性。本研究表明,四黃止痢顆粒復方的主要功效物質并非單一的某個或某類成分,復方藥效是多類成分共同作用的結果,這與本研究中網絡篩選的結果一致。依據四黃止痢顆粒的組方理論進一步推測,各單味藥之間可能通過共有成分相互聯系、相互配合以發揮復方的整體藥效。黃連作為復方君藥,主要通過生物堿類成分對仔豬腹瀉產生治療作用;臣藥中生物堿類成分可能輔助君藥以增強胃腸道的調控功能及抗菌、抗炎作用;佐藥中蒽醌、苷類成分均有較好的抗炎活性,可進一步配合君臣藥發揮治療作用;使藥甘草的活性成分最多,藥理作用廣泛,可調和諸藥藥性。此推測在一定程度上符合復方的組方規則,且本研究也嘗試從物質基礎層面闡釋四黃止痢顆粒中君臣佐使的配伍規律以及明確各單味藥在復方發揮整體抗腹瀉作用過程中的貢獻,但后續仍需進一步的試驗驗證。

3.2 四黃止痢顆粒的作用靶點及功能模塊

蛋白相互作用網絡結果發現,四黃止痢顆粒主要通過作用于35個關鍵靶點蛋白治療仔豬腹瀉,黃連作用于其中28個靶點,占比80%(28/35);黃柏、黃芩不僅作用于黃連調控的所有靶點,還能調控靶點CYCS、NR3C1,甘草還能調控HMGCR、SLPI;大黃、板藍根調控EDN1、HP、NR3C1等17個靶點,其中13個靶點與黃連的靶點重合。結果表明,黃連調控的關鍵靶點與其它藥均存在較高的重合率,是四黃止痢復方中發揮主要治療作用的藥物,為君藥;其它藥物能夠輔助或配合黃連發揮藥效,符合中藥復方的組方規則。在此基礎上,本研究進一步識別并確定模塊1為整個復方的功能模塊。除EDNI外,其包含的16個蛋白與君藥調控的靶點存在交集。CASP3,又稱胱天蛋白酶3,屬于細胞凋亡信號分子。有研究發現木犀草素、川芎嗪等中藥成分能通過調控CASP3介導的外源性死亡受體和內源性線粒體凋亡途徑抑制病毒感染誘導的細胞凋亡[34-36]。EDN1基因編碼的蛋白為內皮素-1,是由血管內皮細胞合成的多功能肽類激素。有研究發現miRNAs與其結合后可參與奶牛乳脂代謝的調控[37]。IL-1是趨化因子家族的一種細胞因子,局部低濃度的IL-1主要發揮免疫調節作用。IL1A、IL1B是其兩種不同的形式,二者結合相同的受體復合物,具有相似的生物學活性。IL1A主要參與調控細胞生長和免疫反應[38]。IL1B可通過抑制鈉-鉀-ATP酶的活性,抑制水、鈉的吸收,促進腹瀉及腸道運動功能紊亂的發生[39]。SERPINE1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,可介導細胞外基質的降解,促進細胞的侵襲和轉移[40-41]。NOS屬于一氧化氮合酶,參與產生信號分子NO。NOS2為鈣非依賴型,在腸道炎癥的發生過程中發揮保護和破壞的雙重作用[42]。NOS3屬于內皮型一氧化氮合酶,是內皮細胞合成NO的關鍵酶,有研究發現黃連素可上調一氧化氮合酶的基因和蛋白表達[43]。SELE是在免疫黏附中起作用的細胞表面糖蛋白,可參與機體腸胃炎性反應[44]。BCL2L1屬于細胞死亡的有效抑制劑,可減輕炎癥損害,抑制IL1B的釋放,參與機體多種炎性反應[45]。IFNG是由T細胞和NK細胞等產生的II型干擾素,通過激活效應免疫細胞和增強抗原呈遞,在抗菌、抗病毒反應中發揮關鍵作用[46]。TNF是在急性炎癥期間由巨噬細胞、單核細胞產生的一種炎癥細胞因子[47]。IL-10是由多種細胞產生的抗炎細胞因子[48]。IL-6是在免疫、組織再生和代謝中具有多種生物學功能的促炎細胞因子[49]。NFKBIA是調控轉錄因子NF-κB進出細胞核的抑制劑[50]。FOS在信號轉導、細胞增殖和分化中具有重要作用[51]。HMOX1是一種血紅素加氧酶,能催化血紅素分解代謝,促使血紅素分解為膽綠素、亞鐵離子和一氧化碳[52]。以往的研究結果表明模塊1包含的靶點蛋白主要參與調控機體的炎癥、免疫調節、氧化應激等過程。因此,本研究通過富集分析模塊1的功能和通路有利于進一步探討四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的作用機制。

3.3 四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的信號通路

比較君、臣、佐、使藥及模塊1的KEGG通路富集分析結果發現,君、臣、使藥能作用于相同的26條信號通路,佐藥、模塊1作用的信號通路均包含其中,進一步表明臣、佐、使藥能輔助、配合君藥發揮治療作用,同時證明模塊1是中藥復方四黃止痢的功能模塊。模塊1主要涉及的通路包括TNF、IL-17、NF-κB等17個炎癥相關信號通路。TNF-α是免疫的中間調節因子[53],通過刺激NF-κB p65的磷酸化使其轉移到細胞核,同時激活多種靶基因[54],形成促炎反應的積極循環[55]。NF-κB信號傳導是一種關鍵的促炎途徑[56]。富集分析結果表明,四黃止痢顆粒主要通過作用于炎癥相關信號通路以達到治療仔豬腹瀉的目的。

3.4 四黃止痢顆粒的歸經分析

歸經,即藥物作用的定位。歸經分析是指把藥物作用與動物機體的臟腑經絡密切聯系起來,以說明藥物作用對機體某部分的選擇性[57]。本研究通過對各單味藥進行歸經分析發現,復方四黃止痢顆粒能作用于動物機體11個臟腑經絡,且主要歸脾、胃經,其次是大腸、心等,表明四黃止痢顆粒趨向于選擇調節脾、胃為主的多個臟腑經絡以發揮止瀉作用,從而為該復方的應用提供理論參考。

本研究通過綜合分析四黃止痢顆粒的主要功效物質基礎、作用靶點及功能模塊、信號通路、歸經,再次驗證了中藥復方多成分、多靶點、多途徑以及多個作用部位的藥理作用特點。此外,通過查閱《中華人民共和國獸藥典》發現,四黃止痢顆粒的質量標準尚不完善,定性鑒別部分僅考慮君藥黃連(鹽酸小檗堿)、臣藥黃芩(黃芩苷)、佐藥大黃的薄層色譜鑒別,含量測定部分僅考慮黃芩苷的含量(每1 g四黃止痢顆粒含黃芩以黃芩苷計,不得少于4.8 mg)[58]。可見,四黃止痢顆粒的質量標準仍缺少臣藥黃柏、佐藥板藍根、使藥甘草的定性鑒別以及其他有效成分的含量鑒定。本研究通過開展中藥靶點-疾病靶點-生物通路-功能模塊多層次關聯網絡分析不僅揭示了四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的關鍵作用機制,其篩選得到的生物堿、黃酮、蒽醌、苷類成分可作為反映中獸藥復方四黃止痢顆粒的潛在質量標志物(quality marker, Q-markers)[59],為進一步提高和完善四黃止痢顆粒的質量標準提供科學依據。

4 結 論

4.1生物堿、黃酮、蒽醌、苷類成分是四黃止痢顆粒復方的主要物質基礎,具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用。方中君臣佐使藥的主要活性成分種類各異,可能通過共有成分相互聯系、相互配合以發揮四黃止痢顆粒復方的整體藥效。

4.2四黃止痢顆粒主要通過作用于功能模塊1調控TNF、IL-17、NF-κB等信號通路,調節脾、胃等臟腑經絡,進而發揮治療仔豬腹瀉的作用。