基于分子標記共祖的亞東鮭育種群體遺傳背景分析

陳孟娟，李 鑫，袁冬冬，孫帥杰，于光晴，戶 國，欒培賢，王萬良，扎西拉姆，周建設

(1.西藏自治區農牧科學院水產科學研究所，拉薩 850000；2.河南農業大學動物科技學院，鄭州 450046；3.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070)

亞東鮭(Salmotruttafario)又名褐鱒、棕鱒，屬鮭形目鮭科魚類，原產于歐洲、非洲北部和西亞一些地區，在19世紀初由英國引進，國內僅在西藏自治區亞東縣內有分布，為西藏自治區特有的冷水經濟魚類[1，2]。該魚周身有紅色和灰色不規則圓點，魚體肥滿，肉質鮮美，其肌肉高度不飽和脂肪酸含量高并且具有豐富且平衡的氨基酸，營養價值較高[3]，具有很大的商業價值。當地政府積極發展亞東鮭養殖業，現已成為亞東縣重點發展的四大特色優勢產業之一。但在亞東鮭產業化發展的過程也存在許多問題，如孵化率低、發病率高、體表色澤暗等，嚴重影響了養殖戶的養殖成本和銷售，亞東鮭由于引進時間較長[4]，經過多代人工繁殖，缺乏人工選育，導致種質生長速度緩慢、個體小型化等現象時有發生。亞東鮭的良種化問題已成為制約其產業化發展的瓶頸。因此，無論亞東鮭作為商品化生產還是野外種質資源的養護需求，以其親本遺傳管理和建立選配策略解決亞東鮭良種化問題已成為當務之急。然而，因近親繁殖導致的資源衰退，僅靠單純數量意義上的增殖放流在經濟、環境和增殖放流效果等方面不可持續，也不利于野生群體的種質資源多樣性建立[5]。亞東鮭在無系譜背景的情況下，由于多代的人工繁殖缺乏實質性選育，如何避免近親繁殖又成為一個難點。

分子標記共祖分析是通過高通量測序獲得的SNP分子標記來替代傳統系譜信息，結合多種統計學方法解析、分析群體遺傳特征，計算如基因組共祖系數(genomic coancestry coefficient，CC)、血緣同源(identity by descent，IBD)、基因組近交系數(genomic inbreeding coefficient)、多維標度分析(multidimensional scaling，MDS)及群體遺傳結構等估計值[6-8]。在沒有系譜資料的育種群體中，通過分子標記共祖分析，獲得個體間的親緣關系信息，實現高效精準估算近交系數和群體近交率，進而從不同的角度揭示群體的近交關系，在水產動物育種中建立以維持物種多樣性水平為保種目標的親本選配策略。

本研究通過分子標記共祖分析，在無系譜信息的亞東鮭育種群體中，基于SNP分子標記替代系譜信息構建實現分子親緣關系矩陣，精準估算個體間親緣關系和群體近交率，以維持物種遺傳多樣性為目標，對亞東鮭育種群體遺傳背景進行分析，為亞東鮭的家系選育及遺傳多樣性的管理提供新的技術方案。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

實驗所用245尾亞東鮭均來自雅魯藏布江漁業資源繁育基地，年齡為3～5齡，平均體長為(30.14±4.69)cm，平均體質量為(533.19±331.28)g。采樣個體之間沒有系譜記錄。使用MS-222將采樣個體進行麻醉后，采用PIT魚類芯片標記的方法，將動物芯片打入背部肌肉進行標記，并剪取脂鰭放入90%的乙醇保存備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取

利用無錫百泰克生物技術有限公司生產的海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取亞東鮭脂鰭基因組DNA，通過瓊脂糖檢測和NanoDrop2000紫外分光光度計(Thermo fisher Scientific)對抽提的DNA質量和濃度進行檢測。DNA產物置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 文庫構建和測序質量分析

按照 double digest restriction site-associated DNA sequencing(dd-RAD)的方式構建文庫，參考基因組大小為2 371.88 Mb，選用的限制性內切酶為EcoRⅠ和BfaⅠ，插入片段在220～450 bp之間。利用第二代測序技術(Next-Generation Sequencing，NGS)，基于Illumina NovaSeq測序平臺，對文庫進行雙末端(Paired-end，PE)測序。得到的原始圖像數據文件經堿基識別轉化成原始測序序列，將拼接好的測序序列進行過濾以保證數據分析結果準確性。首先采用AdapterRemoval(version 2)[9]去除3′端的接頭污染；隨后進行質量過濾和長度過濾，過濾去除雙末端長度≤50 bp的reads，由此獲得可用于后續標記篩查、分型的高質量序列即SLAF標簽。

1.2.3 全基因組序列比對和SNP標記檢測

采用BWAmem[10]程序將過濾后得到的高質量數據比對到參考基因組上，均使用默認參數。采用GATK[11]軟件進行SNP的檢測，進一步對獲得的SNP位點進行過濾，以獲得高質量的SNPs用于遺傳多樣性分析。將獲得的SNP結果進行統計，采用ANNOVAR[12]軟件對SNP位點進行注釋。

1.2.4 群體遺傳結構分析

利用全基因組SNP標記對245個個體的遺傳結構進行分析，設置K值為1-20個，迭代10 000次，通過ADMIXTURE[13]的5倍交叉驗證來選擇適宜的K值。使用PLINK軟件進行多維標度(MDS)分析，以獲得個體間的基因組關系。

1.2.5 群體遺傳多樣性分析

使用R軟件包(DiveRsity)[14]估計群體內平均觀測雜合度(Ho)和平均期望雜合度(He)。所有 SNPs的Ho和He值在群體內逐一計算，然后將平均值作為群體的Ho和He值。使用VCFtools[15]以10 Mb滑窗為單位，步長為2 Mb在整個基因組測量核苷酸多樣性(Pi)。每個群體的平均Pi是由所有滑窗的Pi值的平均值計算出來的，使用R軟件[16]對6個組別的均值進行多重比較，并進行Scheffe檢驗。

1.2.6 群體近交水平和親緣關系

通過基因組共祖系數(CC)和血緣同源率(IBD)兩個參數來衡量個體間的基因組親緣關系。基因組共祖系數的估算是基于每個SNP自身效應的跨SNP標準化的混合模型獲得的，并被計算為基因組成對加性關系的半值(基因組加性關系矩陣的非對角線元素)，并由GVCBLUP軟件[17]中的GCORRMX程序而得出，通過PLINK軟件個體加性關系矩陣對角線元素計算個體近交系數(f)[18]。

1.2.7 群體遺傳分化和基因流分析

通過VCFtools對全基因組以10 Mb滑窗為單位，長為2 Mb進行SNP掃描，估算群體間個體遺傳分化指數(FST)[19]，個體FST的顯著性檢驗使用置換檢驗(10 000個置換)。通過高斯近似法從全基因組等位基因頻率數據中發現遺傳漂變，然后使用Treemix軟件推斷6個群體的歷史分裂和混合的基因流。

2 結果

2.1 測序結果分析

對245個個體通過NGS測序,平均每個樣本獲得17.01 M clean reads,平均GC含量為42.28%,平均Q20百分比為97.84%,平均Q30堿基百分比率93.55%。平均測序深度為14.56,共獲得1 092 509個SNP標記,經過篩選后獲得17 058個SNP數據集,可用于后續的群體遺傳分析。

2.2 群體遺傳結構分析

群體結構是群體遺傳分析的重要內容。本研究對245個個體進行Admixture檢測分析，首先假設測試群體來源于1～20個祖先(K=1～20)，交叉驗證結果表明在K=11時錯誤率最低，其次為K=10。當K=10和11時，遺傳聚類分析結果顯示245個個體可明顯地聚為6個群體(圖1)，其中StfA1、StfC2和StfC3群體中的遺傳組成較為復雜，多數個體來源于不同祖先；StfB1、StfC1和StfC4群體遺傳結構較為簡單，多數個體具有單一的祖先來源(圖1)。

圖1 當K=10和11時，245個個體的遺傳結構Fig.1 Genetic structure of 245 individuals when K=10 and 11

245個個體的多維標度(MDS)視圖結果如圖2a和圖2b所示，遺傳距離接近的群體會聚集在一起，從圖中可以得到StfA1群體、StfB1群體各單獨聚為一簇，并且與其它群體之間的遺傳距離相距較遠；StfC1、StfC2、StfC3、StfC4四個群體遺傳距離較近，并且在二維圖中4個群體間的個體有重疊部分(圖2b)。

圖2 245個個體的相互遺傳距離多維標度分析(a，b)Fig.2 Multidimensional scaling analysis of mutual genetic distance of 245 individuals(a，b)

2.3 群體遺傳多樣性分析

分別統計了6個群體的Ho、He和Pi，結果顯示(表1)，6個群體的Ho范圍為0.283～0.295，其中StfC3群體中遺傳多樣性最高，StfA1群體中遺傳多樣性最低。He范圍為0.238～0.274，其中StfC2和StfC3群體遺傳多樣性相對更高，StfC1群體遺傳多樣性最低。Pi范圍為1.658×10-6～1.884×10-6，He的趨勢與Pi相似。

表1 6個群體的遺傳多樣性分析Tab.1 Genetic diversity among six sampling populations

2.4 群體近交水平估計

根據全基因組SNP數據估計的6個群體平均基因組近交系數如表2所示，StfA1群體基因組近交系數最高，平均基因組近交系數為0.046；StfC3群體基因組近交系數最低，平均基因組近交系數為0.007。StfC3群體的平均基因組近交系數顯著小于StfA1群體，與其他4個群體比較差異不顯著。

245個體中，基因組近交系數大于0.062 5的個體比例占所有檢測個體的19.6%(48/245)，其中StfA1群體為36.3%(37/102)，StfC2群體為5.9%(3/51)，StfC3群體為4.3%(2/47)，StfC4群體為50%(6/12)；基因組近交系數大于0.125的個體有14個，其中StfA1群體中12個，StfC3和StfC4群體中各有1個；基因組近交系數大于0.25的個體1個，在StfA1群體中(圖3)。

圖3 245個個體的基因組近交系數Fig.3 Genomic inbreeding coefficients of the 245 individuals

2.5 群體內和群體間個體親緣關系分析

群體內和群體間個體對親緣關系可以通過CC和IBD來確定，并且可以通過兩者的一致性來進行驗證。六個群體內基因組平均成對親緣關系見表2。StfC1群體中個體對的基因組親緣關系最高(CC=0.169 5±0.043 7，IBD=0.346 4±0.086 7)，StfC2和StfC3群體內個體對的基因組親緣關系相對較遠。群體內CC和IBD熱圖如圖4所示，6個群體內共有115對個體為全同胞近交類型(CC≥0.25)，近交程度屬嫡親，其中StfA1、StfB1、StfC1、StfC2、StfC3和StfC4群體內的個體對分別為55、1、12、22、12和13；958對個體為半同胞、祖孫或叔侄近交類型(0.125≤CC<0.25)，近交程度屬嫡親，其中StfA1、StfB1、StfC1、StfC2、StfC3和StfC4群體內的個體對分別為487、36、142、176、85和32；3 653對個體為堂兄妹、半叔侄或曾祖孫近交類型(0.062 5≤CC<0.125)，近交程度屬近親，其中StfA1、StfB1、StfC1、StfC2、StfC3和StfC4群體內的個體對分別為3 052、54、17、172、337和21。

圖4 245個個體間的基因組配對關系的概圖Fig.4 The overview diagram of genomic pairwise relatedness between the 245 sequenced individualsa為基因組共祖系數(CC)，b為血緣同源率(IBD)。

6個群體間個體親緣關系如表3所示，無全同胞近交類型；半同胞、曾孫或叔侄近交類型的個體對為101對，其中StfC2和StfC3群體間28對，StfC3和StfC4群體間73對；堂兄妹、半叔侄或曾祖孫近交類型的個體對為584對，其中StfC1和StfC2群體間123對，StfC1和StfC3群體間45對，StfC2和StfC3群體間159對，StfC2和StfC4群體間3對，StfC3和StfC4群體間254對。不同群體間個體對基因組共祖系數有的無限接近零或為負數，血緣同源率分析結果除了無負數值出現外，與基因組共祖系數分析結果基本一致(圖4b，表3)。

2.6 有效群體大小估算與基因流分析

6個群體間FST值在0.015～0.164之間(表4)，其中StfA1群體與StfC1、StfC4群體之間的遺傳分化指數較大，分別為0.164、0.160。BALLOUX等[20]以0.05、0.15和0.25為臨界值將群體遺傳分化劃分為很小、中等、較大和很大4個等級。根據此劃分依據，StfC3群體與StfC2、StfC4群體之間遺傳分化程度很小(0≤FST≤0.05)；StfA1群體與StfC1、StfC4群體之間表現出較大的分化水平(0.15≤FST≤0.25)；其它種群之間表現為中等分化水平。

表4 群體間的成對FSTTab.4 Pairwise FST between populations

基因流結果顯示，群體從StfC2群體分裂為兩個分支，一個繼續分裂為StfC1和StfC3群體，另一個繼續分裂為兩個子分支，一個分裂為StfC4群體，一個繼續分裂為StfA1和StfB1群體。其中StfC3群體和StfC4群體基因交流最大，流向為StfC4群體到StfC3群體，其余各種群間也存在相當程度的基因交流(圖5)。

圖5 基因流分析和傳播史推斷Fig.5 Gene flow analysis and spread history inferring for the six populations黑線表示種群擴散的模式，帶箭頭的線表示推斷的遷移方向。

3 討論

3.1 亞東鮭繁殖群體遺傳結構分析

群體遺傳結構[21]指遺傳變異在物種或群體中的一種非隨機分布，按照地理分布或其他標準可將一個群體分為若干亞群，處于同一亞群內的不同個體親緣關系較高，而亞群與亞群之間則親緣關系稍遠。亞東鮭最早是由英國引進養殖的[4]，現已形成穩定的地方種群，并被農業農村部等八部門認定為第三批中國特色農產品。然而，由于引進時間長，未進行有效的人工選育，近親繁殖導致的種質退化現象逐漸顯現，戶國等[22]對野生亞東鮭和褐鱒(Salmotrutta)日本品系群體進行個體親緣關系聚類分析，結果顯示野生型亞東鮭遺傳結構較為簡單，推測野生亞東鮭群體可能正經歷遺傳衰退的情況。亞東鮭群體系譜信息的缺失，使得人工選育工作不可避免地繼續產生不同程度的近親繁殖后代，使得選育周期延長。本研究基于分子標記共祖分析技術替代亞東鮭群體系譜信息，對雅魯藏布江漁業資源繁育基地養殖的亞東鮭繁殖群體進行了遺傳結構分析，結果顯示，245尾亞東鮭明顯地分為6個群體，從PCA主成分分析來看(圖2a，圖2b)，6個群體中StfC1、StfC2、StfC3和StfC4群體間個體有摻雜的情況，說明這4個群體間遺傳距離較近，在實際的育種應用中，避免這4個群體內個體間的選配，以防止近親繁殖帶來的種質退化。StfA1和StfB1兩個群體在PCA主成分分析中分別單獨聚為一簇，并與其他4個群體相聚較遠，推斷這2個群體個體間及與其他4個群體個體間遺傳距離較遠，在實際的亞東鮭育種應用中可以形成強雜種優勢，為后代種質的提純復壯提供育種基礎。

3.2 亞東鮭繁殖群體遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是優良性狀選育的物質基礎[23]，表現在性狀、控制性狀位點的基因型在個體、群體或種的差異等方面，也是評價優良品種或品系的標準之一。本實驗采用Ho、He和Pi遺傳參數，從多個角度來估測亞東鮭繁殖群體的遺傳多樣性，Ho和He是衡量種群遺傳變異程度的重要參數，與種群遺傳多樣性呈正相關[23]。實驗結果顯示6個群體的Ho范圍為0.283±0.189～0.295±0.196，He范圍為0.238±0.190～0.274±0.164，核苷酸多樣性(Pi)范圍為1.658×10-6～1.884×10-6，可以看出6個種群的平均觀測雜合度均高于平均期望雜合度，群體的雜合度能夠較準確反映群體遺傳多樣性，觀測雜合度高一般情況下表明群體遺傳多樣性較豐富，王芳等[24]統計了日本品系褐鱒和亞東鮭He值分別為0.651 7和0.717 1，豪富華[25]發現亞東鮭野生群體的平均觀測雜合度是0.708 3，而本研究中亞東鮭繁殖群體6個抽樣群體的平均觀測雜合度范圍為0.283～0.295，均顯著低于之前的研究結果，揭示了雅魯藏布江魚類資源繁育基地亞東鮭繁殖群體遺傳多樣性在下降，這與目前亞東鮭表現出來的生長速度慢、抗病能力低、體表色澤暗淡等均與種質退化相關，進一步說明目前該基地養殖的亞東鮭存在較嚴重的近親繁殖現象。此外，6個群體的亞東鮭在絕大多數位點的Ho值都大于He值，提示在今后的人工選育過程中，從遺傳多樣性上適當增加群體的豐富性，避免遺傳多樣性的降低。

3.3 亞東鮭繁殖群體親緣關系分析

近親繁殖系數一定程度上反映了群體間親緣關系遠近和遺傳變異程度。近親繁殖系數越高，遺傳距離越近，近交的程度越高。雜交親本間遺傳差異越大，親緣關系越遠，其后代雜種優勢越明顯[26]。基因組共祖系數(CC)和血緣同源率(IBD)是用來直接衡量個體間的親緣關系的，用來反映近親交配的程度。研究結果發現6個群體中，StfC1、StfC2、StfC3和StfC4四個群體(表3)個體間均達到了近親繁殖的程度(0.031 25

3.4 亞東鮭繁殖群體遺傳分化分析

遺傳分化指數(FST)被認為是度量群體間基因分化相對大小的一個較好的指標，FST值高于0.15說明群體間存在顯著性遺傳分化[32]。本研究結果顯示，StfA1群體與StfC1、StfC4群體間的遺傳分化指數為0.164、0.160，遺傳分化程度顯著，說明StfA1群體與StfC1、StfC4群體間的遺傳差異較大，其他群體間遺傳分化程度都處于中等水平，說明群體間遺傳差異處于中等及以上的程度。基因流是影響群體間遺傳分化水平的重要因素，它能夠減少群體間的遺傳分化，使群體趨向于一致，當群體間基因流值大于1時，能夠有效地抑制群體間遺傳分化的產生[33]。在自然群體中，群體的分化差異程度與群體間的基因流大小緊密相關，即如果不同群體間的基因流強度越高，則該群體間的分化差異程度則相對越小[34]。本研究中6個群體的基因流均小于0.05，表明各群體間基因交流較少，產生了相應的遺傳分化，這與FST的統計結果相一致。