兩性霉素B制劑細胞毒性測定法

毛文學 余音 李欣鈺 余丹丹

（上海研諾醫藥科技有限公司 上海 201114）

兩性霉素B（AmB）是一種多烯類廣譜抗真菌抗生素，是治療敏感深部真菌感染的首選藥物之一[1-3]，但AmB 的作用機制決定了其在破壞真菌細胞的同時也會導致人體正常細胞損傷，影響細胞膜的運輸，長期使用還會造成腎損傷及循環系統的損傷，表現出蛋白尿、氮質血癥、低血鉀、貧血等癥狀[4]。Kagan 等[5]在研究AmB制劑時以酵母細胞為模型，通過酵母的存活率和細胞內K+濃度來評價AmB 制劑及AmB-阿拉伯半乳聚糖共軛物（AmB-arabinogalactan conjugate，AmB-AGC） 聯合用藥的毒性變化。Gruda 等[6]以紅細胞中K+的保留量為指標，證明蔗糖單月桂酸酯能夠在不降低AmB 抑制真菌能力的同時消除其對紅細胞的毒性。de Araújo 等[7]的研究表明AmB 膠束對紅細胞的毒性與K+的泄漏呈濃度依賴性。

國內外諸多圍繞AmB 劑型改良、聯合用藥及拓展應用的研究都以其毒性為重要評價指標[8-10]，利用AmB增加細胞膜通透性導致單價陽離子泄漏的特點，以泄漏的K+含量表征AmB 制劑毒性。在其他相關研究中，K+含量的測定多使用火焰光度計、原子吸收分光光度計、電解質分析儀及生化分析儀等設備[7,11-12]。實驗結果的精確度會受設備及樣本處理方法等因素的影響，如火焰光度計無法測出元素的絕對濃度值，而生化分析儀由于樣本處理中使用肝素抗凝劑，會影響靜脈血清K+測定，導致測得的K+含量偏高。本研究選擇紅細胞為載體，以HPLC 法對紅細胞滲漏的K+濃度進行檢測，建立了一套針對AmB 制劑的毒性評價方法。此方法能夠準確高效地評價工藝及處方對細胞毒性的影響，為AmB 制劑的研究應用拓寬了道路。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

10%大鼠紅細胞（批號：BC20200809、BC20200813、BC20200818，南京生航生物技術有限公司；批號：20200811、20200814、20200823，南京森貝伽生物科技有限公司）；AmB 原料藥[梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]、AmB 脂質體凍干制劑（自制）；其余化學制劑均為市售分析純。

1.2 儀器

E2695 高效液相色譜儀（Wasters 公司，帶檢測器2424 ELS Detector）；XS205 型分析天平（Mettler Toledo公司）；MX-RD-Pro 型旋轉混勻儀[大龍興創實驗儀器（北京）股份公司]；GNP-9050 型恒溫箱（上海精其儀器有限公司）；TGL-16.5M 型離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.3 溶液配制

1）PBS 溶液 配制含147 mmol/L 氯化鈉、3 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 磷酸氫二鈉的PBS 溶液，以1 mol/L HCl 調節pH 至7.4±0.1 保存備用[9]。

2）陽性對照液 準確稱取AmB 原料藥50 mg、脫氧膽酸鈉41 mg、磷酸鈉 20.2 mg，加入純化水10 mL溶解，得5 mg/mL AmB 脫氧膽酸鹽溶液，以PBS 稀釋至1 mg/mL。

3）供試品溶液 取AmB 脂質體凍干制劑1 支（每支含AmB 50 mg），加入純化水10 mL 復溶，得約5 mg/mL AmB 脂質體溶液，以PBS 分別稀釋至1 mg/mL、500 和250 μg/mL。

4）陰性對照液 PBS 溶液。

1.4 紅細胞預處理及樣品孵化

1）紅細胞洗滌濃縮 取市售10%大鼠紅細胞45 mL，用PBS 溶液離心洗滌（500 g，10 min，4 ℃）4 次至上清澄清后加入PBS 溶液分散并定容至10 mL，得45%大鼠紅細胞懸液。

2）紅細胞孵化 取45%大鼠紅細胞450 μL 于1.5 mL 離心管內，分別加入陽性對照、供試品或陰性對照50 μL，混勻。將離心管固定于旋轉混勻儀上，于37 ℃恒溫箱內以12 r/min 水平旋轉孵化。于取樣時間點取出樣品，離心（1 000 g，10 min，4 ℃）后取200 μL 上清液于液相進樣小瓶中，加超純水800 μL，混勻得稀釋5倍的供試品溶液，按HPLC 條件進行分析。

1.5 HPLC 鉀離子含量檢測色譜條件

采用Waters XBridge Hilic 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1 mol/L 乙酸銨- 乙腈=15 ∶85；流速1 mL/min；進樣量10 μL；載氣206.84 kPa；漂移管溫度80 ℃；運行時間20 min。

2 結果

2.1 K+釋放與紅細胞孵育時間關系考察

陰性對照的K+釋放濃度未隨孵育時間而增加，表明本研究采用的孵化條件對大鼠紅細胞細胞膜通透性無顯著影響，不會造成K+額外滲漏。作為陽性對照的1 mg/mL AmB 脫氧膽酸鹽溶液于孵育后0.5 h 內快速釋放K+并于1 h 時達平臺濃度。相較于陽性對照，不同濃度的AmB 脂質體對大鼠紅細胞的急性毒性顯著減小，且K+釋放呈時間與濃度依賴性，并于4 h 時達到最大K+釋放濃度（圖1）。為保證實驗結果準確性，后續研究中將4 h 作為考察AmB 制劑細胞毒性的孵育時間。

圖1 孵育時間對大鼠紅細胞K+釋放的影響

2.2 大鼠紅細胞K+釋放重復性考察

為考察方法重復性，分別使用了陽性對照液、不同濃度AmB 脂質體溶液及陰性對照液按前述方法進行實驗，并檢測紅細胞K+釋放濃度，實驗結果顯示，經過4 h 孵育，陽性對照組紅細胞K+釋放濃度最高，AmB 脂質體引起的紅細胞K+釋放濃度隨AmB 濃度的降低而降低，表明大鼠紅細胞K+釋放濃度與供試品溶液中AmB濃度正相關（表1）。同組平行孵育的4 管樣品除AmB脂質體250 μg/mL 組RSD 大于5%外，其余各組RSD均小于4%（表1），樣品組內平行性好，證明本方法重復性良好，能夠滿足考察AmB 及其制劑細胞毒性評價的要求。

表1 孵育4 h后不同濃度AmB脂質體溶液對K+釋放的影響（n=4）

2.3 大鼠紅細胞K+釋放批間差異考察

為研究大鼠紅細胞質量對實驗結果的干擾程度，我們分別對兩個公司各3 批市售10%大鼠紅細胞進行了對比研究。實驗結果顯示，購自南京生航的3 批大鼠紅細胞在分別給予陽性對照液和陰性對照液4 h 后K+釋放濃度穩定，批間差異小，僅1 mg/mL AmB 脂質體溶液孵育的紅細胞樣品表現出了較大批間差異（表2）；南京森貝伽3 批大鼠紅細胞K+釋放濃度均表現出較大批間差異，其中批次3 的AmB 脂質體溶液組K+釋放濃度顯著高于同組其余2 批紅細胞且高于陽性對照組，導致批間RSD達26.69%；同時，批次3 陽性對照組K+釋放濃度低于同組另2 個批次（表3）。綜合對比南京森貝伽各組別實驗結果，提示批次3 大鼠紅細胞質量可能是導致出現不符合不同AmB 制劑間細胞毒性規律結果的原因。

表2 南京生航3批次大鼠紅細胞孵化4 h后K+釋放濃度

表3 南京森貝伽3批次大鼠紅細胞孵化4 h后K+釋放濃度

2.4 紅細胞儲存時間與細胞毒性變化考察

對于細胞水平的體外毒性研究而言，除了細胞來源與批次之間的差異，細胞在儲存過程中的變化對于實驗結果的準確性也會產生一定影響。因此，對同一廠商的3 批大鼠紅細胞分別在入庫當日于2 ～8 ℃保存7 d 后，與AmB 脫氧膽酸鹽溶液（1 mg/mL）孵育進行對比。3批次紅細胞在入庫當日（0 day）K+釋放濃度無顯著差異，保存7 d 后3 批次紅細胞K+釋放量均有不同程度的下降（圖2）。根據實驗結果推測，部分紅細胞在儲存過程中失活皺縮，且市售紅細胞的保存液不能完全阻止其緩慢釋放K+，致使部分K+在洗滌濃縮過程中被去除，從而導致紅細胞內K+濃度隨儲存時間延長而下降。這可能是保存7 d 后大鼠紅細胞K+釋放濃 度整體降低的原因。

圖2 大鼠紅細胞實驗前保存時間對K+釋放的影響

3 討論

實驗結果表明，本研究建立的方法可以精確測定出不同劑型、不同濃度、不同孵育時間紅細胞釋放的K+含量，并且不受其他雜質離子的干擾。相較于使用實驗動物為模型的毒性半數致死劑量實驗、細胞毒性實驗的MTT 法、細胞毒性克隆實驗等傳統毒性評價手段[13]，本方法不需要流式細胞儀和熒光標記物等特殊儀器設備及耗材，具有成本低、周期短、易操作、對實驗環境要求低等特點。同時，紅細胞作為血液中占比高達40%～45%的細胞，來源廣泛，易于獲取；其具有完整的細胞膜結構，且細胞內含有高濃度的K+，結合HPLC 檢測，實驗結果精確度高，更適合作為制劑處方、工藝變更的快速安全評價方法。

值得注意的是，細胞作為一種活體評價載體，會因種屬來源、采集方式、儲存及運輸等不同因素而造成細胞生理活性上的差異。因此，為保證實驗結果的準確性，應在實驗中適當增加空白樣、平行樣或對照樣。還應嚴格控制紅細胞從采集到使用的各中間環節，包括避免長時間遠距離運輸、將紅細胞于2 ～8 ℃低溫保存但不可凍融、運輸及使用過程中避免劇烈震蕩引發的溶血、保持無菌狀態并在開封后盡快使用完畢等注意事項。如有條件，宜從可靠的動物中心采購固定種屬的大鼠或采用固定來源的現制紅細胞，即于實驗當日在無菌條件下采血提取紅細胞進行藥物細胞毒性實驗，以消除種屬間差異及運輸儲存條件對實驗結果的干擾。

綜上所述，本方法不僅可以用于AmB 原料藥和脂質體注射劑細胞毒性的快速測定，根據其實驗原理還能應用于其他AmB 劑型和能夠導致K+泄漏的藥物及其制劑的研究中，是一種具有良好前景的藥物細胞毒性評價方法。