多黏菌素B中多種單體的制備

朱鑫磊 江錫銘 黃臻輝

(上海上藥第一生化藥業有限公司 200240)

多黏菌素B 是一種由多黏芽孢桿菌發酵產生的堿性高分子多肽類抗生素，對革蘭陰性菌有強效殺菌作用，但因有腎毒性和神經毒性，過去使用較少。隨著超級耐藥菌的出現，多黏菌素B 被再次啟用，作為治療泛革蘭陰性菌感染的最后選擇[1-3]。其組成較為復雜，包含多種單體[4-9]，文獻雖然提及相關分離純化工藝，但未涉及運用高效液相分離各主要單體的內容。本文闡述運用高效液相色譜分離硫酸多黏菌素B 中各單體及其制備過程，為硫酸多黏菌素B 成分研究及臨床使用提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 儀器與主要試劑

1260 分析型高效液相色譜儀（Agilent 公司）；SD-1制備型高效液相色譜儀（Varian 公司）；FE20 pH 計（Mettler Toledo 公司）；真空冷凍干燥機（上海東富龍制藥設備制造有限公司）；SolariX 7.0T 型傅里葉變換離子回旋共振質譜儀（Bruker 公司）。

硫酸多黏菌素B 原料藥（武漢匯海醫藥有限公司）、乙腈（星可高純溶劑有限公司，制備級）、磷酸（Fisher公司，HPLC 純）；水為本公司自制純化水。

1.2 高效液相色譜分析

參考中國藥典（2015 年版）硫酸多黏菌素B 項下的分析方法[4]，選擇Diamonsil Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技公司），以硫酸鈉溶液（4.46 g 無水硫酸鈉溶解在900 mL 水中，用磷酸調節pH 至2.3 后用水定容至1 L）-乙腈（78 ∶22）為流動相，等度洗脫，流速為1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL，檢測波長215 nm。

1.3 硫酸多黏菌素B 成分分析

多黏菌素B 是微生物發酵產物，由一系列結構類似的環脂肽化合物組成，其主要單體包括有效成分多黏菌素B1和B2、主要雜質B3和Ile-B1、其他已知雜質B6和Ile-B2及一些未知單體（圖1）。其中多黏菌素B1、B2、B3、Ile-B1、Ile-B2及B6的骨架結構基本相同，僅在兩個取代基上有所不同（圖2，表1）。

表1 多黏菌素B各單體的化學結構區別

圖1 硫酸多黏菌素B各單體色譜圖

圖2 多黏菌素B的化學結構圖

1.4 各單體制備液相分離純化

1.4.1 初步分離

稱取3 g 硫酸多黏菌素B 原料藥，用純化水溶解，制備成質量濃度為600 mg/mL 的溶液，通過制備液相進行初次制備分離。

Kromaisl 10-100 C18制備色譜柱[50 mm×250 mm，10 μm；安捷倫科技(中國)有限公司]；流速100 mL/min；檢測波長λ=215 nm，流動相A1：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸調節pH 至2.43），B：乙腈；按表2 進行初次洗脫。分管收集洗脫峰為B1、B2、B3、Ile-B1、Ile-B2與B6的初次分離產物溶液，HPLC 測定后，分別合并純度大于80%的收集液，待進一步純化。

表2 初次分離梯度洗脫

部分收集液濃度低，體積大，可采用先上柱富集再梯度洗脫（表3），經旋轉蒸發儀減壓除去乙腈后，再上樣純化。體積小的部分通過加水稀釋，將乙腈濃度降至12%以下后直接上樣純化。

表3 富集梯度洗脫方法

1.4.2 多黏菌素B1

Kromaisl 10-100 C18制備色譜柱（50 mm×250 mm，10 μm；自裝）；流速100 mL/min；檢驗波長λ=215 nm，流動相A2：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用2.5 mol/L H2SO4調節pH 至2.92），B：乙腈；按表4 進行梯度洗脫。合并純度大于95%的收集液。

表4 B1梯度洗脫

1.4.3 多黏菌素Ile-B1與B3

Ile-B1與B3的初次收集液分別通過反相高效液相色譜進行二次純化，收集洗脫峰。層析條件同1.4.2，按表5 梯度洗脫，合并純度大于98%的收集液。

表5 Ile-B1與B3梯度洗脫

1.4.4 多黏菌素B2

B2收集液（純度約87.6%)，先經制備柱進行富集，洗脫液經旋轉蒸發儀減壓除去乙腈后，采用Kromaisl 7-100 C18制備色譜柱（50 mm×250 mm，7 μm；自裝），流動相A3：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸調節pH 至3.5），按表5 梯度洗脫，合并純度大于98%的收集液。

1.4.5 多黏菌素Ile-B2

合并純度>95%的收集液，分多次上柱純化。采用UniPS 5-300 C18AQ 制備色譜柱（21.2 mm×250 mm，5 μm；納微科技公司），流速20 mL/min，流動相A4：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸調節pH 至2.54），按表6 梯度洗脫，合并純度大于99%的收集液。

表6 Ile-B2梯度洗脫

1.4.6 多黏菌素B6分離純化

合并純度>95%的收集液，分多次進行純化。層析條件同1.4.5，按表7 梯度洗脫，合并純度大于97%的收集液。

表7 B6梯度洗脫

2 結果

2.1 相關單體的檢測結果

各單體的收集液，經減壓濃縮去除乙腈后，冷凍干燥，獲得6 個單體（表1）。通過ESI-MS 檢測，表明各單體的相對分子質量的檢測值與理論值相符（表8），確認是目標單體，經HPLC 分析（圖3），純度均大于96%，可供相關質量研究使用。

表8 各單體ESI-MS檢測

圖3 多黏菌素B各單體HPLC譜圖

2.2 初次純化條件的優化

為提高工藝效率，在保證各單體分離度的條件下，須盡可能提高單次上樣量。當單次上樣量達到3 g 時，已經出現B2、B3單體難以分離的情況。故最初次制備分離的上樣量為每次3 g。

通過實驗對比，發現在相同的洗脫條件下，采用UniSil C18AQ（21.2 mm×250 mm，10 μm；納微科技公司）的制備柱和100 mg/mL 的硫酸多黏菌素B 上樣液，經反相制備液相純化，以流動相A（磷酸調節pH 至3.2）-B（78.5 ∶21.5）等度洗脫，單體Ile-B2與B6的分離效率較佳。

3 討論

本研究發現，相同洗脫條件下，降低流動相A 的pH 可使部分單體的出峰時間提前；精制時，適度調整其酸度能取得更好的純化效果。另外，使用磷酸調節流動相A 的pH 時，制備液相圖譜峰型優于使用硫酸。Ile-B2和B6出峰時間相近，在實際操作中使用磷酸調節流動相A 的pH，其分離效果好于硫酸，能使兩者更好地分離。

本研究建立了一種通過反相液相色譜法直接從硫酸多黏菌素B 中分離出各高純度單體的方法，相比定向合成對應的單體，省時、高效、經濟，可重復性強，設備和材料需求低。所制備的樣品純度均大于96%，符合相關質量研究的要求，能降低企業相關質量研究的成本，為本公司開展產品“硫酸多黏菌素B”的相關臨床研究提供了技術支持。

致謝：上海交通大學分析測試中心桂娟老師幫助完成各單體的質譜數據分析。