m6A去甲基化酶FTO在甲狀腺癌細胞中的作用及機制研究

田 潤，溫思妮，劉翰元，韓 菲，2，朱小年，2，譚盛葵，2，張慧霞，2，

（1．桂林醫學院公共衛生學院，廣西 桂林 541199；2．廣西環境暴露與全生命周期健康科技重點實驗室，廣西 桂林 541199）

2020年，新發甲狀腺癌病例數居全球新增癌癥病例數第11 位[1]，且甲狀腺癌的發病率呈持續上升趨勢[2]。由于甲狀腺癌具有隱蔽性強、進展緩慢的特點，一些患者在初診時就已發生腫瘤轉移[3]，且晚期甲狀腺癌患者5 年生存率較低。據文獻報道，甲狀腺癌的發生與癌基因的激活和抑制調控有關，因此揭示甲狀腺癌相關基因及其調控機制對于甲狀腺癌的早期診斷和治療具有重要意義[4]。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是真核細胞生物包括人類中最豐富的表觀遺傳修飾[5]。m6A甲基化也作為最常見的RNA 修飾形式，通過影響RNA 的選擇性剪接、穩定性核輸出、mRNA 降解和翻譯來調節靶RNA的轉錄后表達[6-8]。其調控作用由甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase-like protein 3，METTL3）和威爾姆斯瘤相關蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）、去甲基化酶脂肪質量和肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein， FTO）、ALKB 同源 物5（AlkB homolog 5，ALKBH5）、RNA 結合蛋白YTH N6-甲基腺苷RNA 結合蛋白1（YTH domain-containing protein 1，YTHDF1）和YTH N6-甲基腺苷RNA 結合蛋白2（YTH domain-containing protein 2，YTHDF2）等介導[9-11]。越來越多的研究表明，m6A 修飾在多種人類癌癥的發生發展中起著重要作用，包括膠質母細胞瘤[12]、胰腺癌[13]和口腔鱗狀細胞癌[14]等。然而，m6A RNA修飾調控因子FTO與甲狀腺癌的關系尚不清楚。另外，MAPK-JNK 作為絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族的成員，其在癌癥中是一個重要的信號轉導通路[15]。研究發現，JNK 的表達水平在甲狀腺癌組織中普遍升高，并與甲狀腺癌的病理特征、惡性程度和預后相關[16]。因此，MAPK-JNK 途徑的研究不僅可以深入了解甲狀腺癌的發生機制，還可以為甲狀腺癌的治療提供新的靶點和策略。

因此，本研究將通過FTO敲低質粒轉染甲狀腺癌細胞后，經m6A 甲基化定量檢測試劑盒檢測甲狀腺癌細胞m6A 甲基化修飾水平，采用平板集落形成實驗、細胞增殖實驗、劃痕實驗，Transwell 實驗分析m6A 去甲基化酶FTO對甲狀腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力的影響，通過Western blot 實驗分析FTO 對MAPK通路的調控機制，旨為甲狀腺癌的早期篩查與防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細胞8505C，均購自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑DMEM 培養基、Opti-MEM 培養基購自美國Gibco 公司；Lipo 3000、PageRulerTMPlus 預染蛋白分子量標準購自美國Thermo Forma 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自日本Dojindo公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot 溶液套裝、SDSPAGE 凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；FTO敲低質粒購自上海吉凱基因公司；m6A RNA甲基化定量檢測試劑盒購自美國Epigentek 集團公司；Transwell 遷移/侵襲小室購自美國Corning公司；RIPA裂解液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；上皮間質轉化（EMT）抗體試劑盒購自美國Epigentek 集團公司；兔抗人FTO 抗體（bs-7056R）購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗人C-Jun 抗體（GTX134395）購自美國GeneTex公司；兔抗人MLK3抗體（11996-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.1.3 儀器超凈操作臺購自天津市泰斯特儀器有限公司；CO2培養箱購自美國Thermo Forma 公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司；酶標儀購自美國Thermo Forma 公 司；伯 樂Western blot 裝 置/ChemiDoc MP 成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養細胞培養于含有10%胎牛血清和1%的青鏈霉素混合液（100 ×）的DMEM 混合液中，并置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中，觀察細胞培養基顏色及顯微鏡下密度，及時換液和傳代。

1.2.2 質粒轉染FTO敲低程度不同的兩種質粒設為2個實驗組（分別命名為實驗組1和實驗組2），另設1個空載陰性對照質粒組，參考Lipofectamine 3000使用說明，將質粒和脂質復合物加入細胞中培養。質粒混合液及脂質混合液比例如下：質粒混合液125 mL，含4 mL Lipo 3000、2 mL 質粒和119 mL Opti-MEM；脂質混合液125 mL，含3.75 mL Lipo 3000 和121.25 mL Opti-MEM。轉染后8 h 換回普通培養基，熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況，并進行后續細胞實驗。

1.2.3 m6A甲基化水平檢測用TRIzol 法提取轉染后的實驗組和對照組細胞總RNA，使用Nanodrop 2000測定RNA濃度。使用RNA甲基化定量試劑盒檢測m6A甲基化水平，并用酶標儀在450 nm 處檢測吸光度值D（450）。m6A甲基化水平計算公式如下。

1.2.4 細胞增殖實驗將轉染的甲狀腺癌細胞重懸后按每孔1×105個接種于96孔板中，每孔含100 mL細胞培養液，每組3 個復孔。分別于接種后12、24、48、72 、96 h每孔加入10 mL的CCK-8試劑，37 ℃孵育3.5 h，酶標儀450 nm 波長檢測每孔吸光度D（450），隨后分別于第1～4 天的相同時間測定D（450），并繪制細胞生長曲線。

1.2.5 平板集落形成實驗取轉染后處于對數生長期的各組細胞，以2 000個/皿細胞將每組細胞分別接種到含有2.5 mL完全培養基的6孔板中，置37 ℃、CO2體積為5%及飽和濕度的細胞培養箱中培養。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時終止培養，并用4%多聚甲醛固定細胞，使用結晶紫染液染色，待干燥后將6孔板置于顯微鏡（低倍鏡）下拍照記錄全平板細胞生長情況，并通過ImageJ軟件計算實際集落數。

1.2.6 劃痕實驗將轉染后的細胞種植在經Marker筆劃橫線定位的孔板中。當細胞匯合率達90%～95%時，用200 mL槍頭垂直劃痕，保持200倍鏡下劃痕寬度均勻且占據整個視野1/3。使用PBS清洗脫落細胞，并加入2%的FBS 培養基2 mL。于0、12、24 h 時，將細胞置于200 倍鏡下于同一視野拍照記錄劃痕愈合狀況，通過ImageJ 軟件計算不同時間段的劃痕處面積，并根據公式計算劃痕閉合率。

1.2.7 Transwell 遷移實驗將轉染后的細胞加入無血清培養基稀釋為2×105個/mL，取200 mL 細胞懸液加Transwell 遷移小室，外室中加入600 mL 完全培養基，放入培養箱培養。并于48 h 后終止培養，使用4%多聚甲醛固定，并使用1%結晶紫染色，用棉簽輕擦內室未穿過細胞。在200 倍鏡下上下左右中各選取一個視野拍照并使用ImageJ軟件計數并統計結果。實驗重復3次。

1.2.8 Transwell 侵襲實驗將Transwell 侵襲小室從-20 ℃冰箱取出放置于4 ℃解凍，加入無血清培養基，37 ℃活化過夜使其凝固，其余剩下的步驟同遷移實驗。

1.2.9 Western blot 實驗將轉染后的細胞按RIPA裂解法裂解，使用BCA法測定蛋白濃度。將細胞按比例加入5×電泳上樣緩沖液中，于100 ℃加熱蛋白8 min。按Bio-Rad說明書組裝凝膠模具，按說明書配制不同比例的濃縮膠，各凝膠孔加入20 μg 蛋白樣品；電泳設置恒壓80 V、40 min 左右，溴酚藍進入分離膠后，調整電壓至120 V，溴酚蘭到達分離膠的底部位置時結束電泳；轉膜設置電流300 mA、60 min，于冰水浴的狀態下進行轉膜；在室溫中用封閉液封閉條帶2 h；在4 ℃中分別使用FTO、GAPDH、Ecadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、MLK3 和C-JUN對應的一抗工作液孵育條帶24 h；在室溫中分別使用對應的二抗工作液孵育條帶1 h；在室溫中將條帶放入ECL工作液中孵育10 s，使用凝膠成像系統獲得蛋白條帶圖。重復3 次，所得蛋白條帶圖用ImageJ 進行定量分析，以GAPDH 蛋白條帶灰度值作為內部參照。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 9.0 軟件對實驗數據進行分析，計量資料采用±s表示，兩組比較采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 FTO對甲狀腺癌細胞m6A甲基化水平的影響

將FTO 敲低質粒轉染人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細胞8505C 后，經比色法檢測細胞m6A 甲基化水平。結果如圖1 所示，與空載質粒陰性對照相比，FTO 敲低后甲狀腺癌細胞的m6A 甲基化水平明顯升高，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 FTO對甲狀腺癌細胞m6A甲基化水平的影響

2.2 FTO對甲狀腺癌細胞增殖能力的影響

通過FTO 敲低質粒轉染人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細胞8505C后，經CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖能力。結果如圖2 所示：在48 h 以后，與空載質粒相比，FTO敲低TPC-1細胞、SW-579和8505C細胞增殖活性明顯升高（均為P＜0.01）。經平板集落形成實驗檢測細胞的增殖能力，在種板后10 d左右，與空載質粒相比，FTO敲低TPC-1細胞、SW-579和8505C細胞增殖能力均有不同程度的升高，差異均具有統計學意義（均為P＜0.05），結果如圖3所示。

圖2 CCK-8試劑盒檢測各組細胞的增殖能力

圖3 平板集落形成實驗檢測FTO敲低后甲狀腺癌細胞增殖能力的變化

2.3 FTO對甲狀腺癌細胞遷移能力的影響

通過FTO 敲低質粒轉染人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細胞8505C 后，經劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。如圖4 所示，從劃痕實驗的結果可以看出與陰性對照相比，FTO敲低后TPC-1細胞、SW-579和8505C細胞的劃痕閉合率明顯升高（P＜0.05或0.01）。

進一步采用Transwell 遷移實驗檢測細胞的遷移能力，結果如圖5所示，FTO敲低后實驗組1與實驗組2的TPC-1 細胞、SW-579 和8505C 細胞遷移數目均高于陰性對照組，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 Transwell細胞遷移實驗檢測FTO對甲狀腺癌細胞遷移能力的影響

2.4 FTO對甲狀腺癌細胞侵襲能力影響

Transwell 侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力，結果如圖6所示，FTO敲低后實驗組1與實驗組2的TPC-1細胞、SW-579 和8505C 細胞侵襲數目均高于陰性對照組，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

圖6 Western blot法檢測FTO敲低后甲狀腺癌細胞上皮間質轉化以及MAPK信號通路蛋白的表達

2.5 FTO 對甲狀腺癌細胞上皮間質轉化以及MAPK信號通路相關蛋白的影響

通過FTO 敲低質粒轉染人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細胞8505C后，經Western blot實驗分析上皮間質轉化以及MAPK 信號通路蛋白水平變化。結果如圖6 和圖7 所示，與陰性對照相比，FTO 敲低后的TPC-1 細胞、SW-579 細胞和8505C 細胞FTO 蛋白水平表達顯著下調，E-cadherin 和β-catenin 的表達相對降低，N-cadherin 和vimentin 的表達相對升高、MLK3 和C-JUN蛋白的表達明顯增加（均為P＜0.05）。

圖7 Western blot檢測FTO敲低后甲狀腺癌細胞上皮間質轉化以及MAPK信號通路蛋白表達的半定量分析結果

3 討 論

甲狀腺癌是一種常見的惡性腫瘤，其發病率不斷上升。盡管已經取得了一定的治療進展，但甲狀腺癌的發病機制仍不完全清楚。甲狀腺癌可分為4 種類型：間變性癌、濾泡性癌、髓樣癌和乳頭狀癌[17]。大多數甲狀腺癌患者被診斷為分化型甲狀腺癌，惡性程度較低。其中，甲狀腺未分化癌的患者，由于甲狀腺細胞高度異型化、失去甲狀腺細胞特征，并呈現出髓樣式，易于發生轉移和復發[18]。另外，由于甲狀腺癌具有隱蔽性強、進展緩慢的特點，一些患者在初診時也會出現腫瘤轉移[3]，對患者健康產生嚴重影響。

m6A 甲基化也在甲狀腺癌的發生和發展中發揮著重要作用。有研究發現，甲狀腺癌細胞中m6A 甲基化的水平通常比正常甲狀腺組織高，且m6A 甲基化酶的表達異常也與甲狀腺癌的發生相關[19]。m6A 甲基化的異常可能影響甲狀腺癌細胞的基因表達和信號通路，從而促進癌細胞的生長和轉移[20]。其中FTO 作為第一個發現的m6A 家族基因，具有調節細胞生物學過程的作用，如脂肪生成、mRNA 剪接等過程，在甲狀腺癌中可能扮演著重要的角色。因此，本研究選擇了不同類型了甲狀腺癌細胞（人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細胞8505C），通過FTO 蛋白的敲低實驗，探索其在甲狀腺癌細胞中對侵襲、遷移和增殖能力的影響，以深入了解FTO在甲狀腺癌發展中的作用機制。

研究結果表明，在TPC-1、SW-579和8505C甲狀腺癌細胞中，FTO 蛋白的敲低可以導致細胞的侵襲、遷移和增殖能力增強。這一發現間接支持了FTO在甲狀腺癌中作為一個促癌基因的假設。具體來說，FTO蛋白的敲低導致了上皮間質轉化過程的改變，即Ecadherin和β-catenin的降低以及N-cadherin 和vimentin的升高。這些結果表明FTO蛋白在調控細胞間質連接和細胞形態的過程中發揮了重要作用。同時越來越多的證據表明，FTO 與結直腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的發生發展也存在一定的相關性[21-24]。

另外，本研究還觀察到FTO 敲低后MLK3 和C-JUN蛋白的表達明顯增加。這表明FTO蛋白可能通過影響MAPK 信號通路的活化來調節甲狀腺癌細胞的生物學行為，與文獻[25-27]報道一致。MAPK 信號通路在許多癌癥類型中發揮著重要作用，包括細胞增殖、侵襲和轉移等過程。因此，我們推測FTO通過調控MAPK信號通路參與了甲狀腺癌的發展和惡化。

盡管本研究揭示了FTO在甲狀腺癌細胞中的重要作用，但仍存在一些問題需要進一步研究。首先，我們需要深入了解FTO 蛋白與上皮間質轉化和MAPK 信號通路的調節機制，包括與其他調控因子的相互作用和下游效應的探究。此外，對于FTO在甲狀腺癌發展的臨床意義和潛在的治療靶點也需要進一步研究。

綜上所述，本研究通過FTO 蛋白的敲低實驗發現，在甲狀腺癌細胞中FTO 的降低導致了細胞侵襲、遷移和增殖能力的增強。這為進一步理解甲狀腺癌的發病機制提供了新的線索。然而，對于FTO在甲狀腺癌中的詳細作用機制和臨床意義仍需要進一步的研究。我們相信這些研究結果將為甲狀腺癌的治療和預防提供新的靶點和策略。