以結果驗證為導向的中醫學八年制Western Blot實踐教學

林玩福 梁淑芳 杜娟 翟笑楓 程彬彬

摘要 “實驗中醫學”是海軍軍區大學中醫學八年制學員的主干課程。其中WesternBlot是研究蛋白水平的基本方法，也是學員所必須掌握的實驗研究方法。本課程以結果驗證為導向的教學方式革新，最大限度壓縮每個步驟的操作時間，聚焦于讓學員完成最多的實驗步驟，力求實驗的完整性。該方法可在一堂課完成實驗，展示結果并進行分析討論。該教學方式有助于在最短時間內掌握完整的Western Blot實驗技術，值得進一步推廣應用。

關鍵詞 實踐教學；Western Blot；實驗中醫學

中圖分類號：G642文獻標識碼：ADOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2023.6.009

《“十四五”中醫藥發展規劃》提出：“推動中醫藥高質量發展和走向世界，為全面推進健康中國建設、更好保障人民健康提供有力支撐”。中醫藥若想走向世界并獲得國際認可，不僅需要客觀療效，還需要用現代科學語言去解釋傳統的中醫理論以及中藥的作用機制[1]。實驗中醫學是用現代實驗的方法和手段來研究中醫基礎理論、中醫診斷、中藥和方劑的一門學科，是現代中醫藥學的一個重要組成部分[2]，對培養中醫藥創新型人才起著重要作用[3]。

海軍軍醫大學（以下簡稱“我校”）于2014年在全國醫科院校率先開辦了中醫學專業八年制教育[4]。相較于浙江中醫藥大學等高校本碩一貫制的中醫八年制學員，我校該專業學員畢業授予博士學位。因此，其科研創新能力需以中醫學博士研究生的要求為基準，意味著該學制學員需在更短的時間內達到同樣的培養目標[5-6]。實驗中醫學的教學內容涵蓋了從整體動物、組織器官、細胞生物、生物分子學到組織形態學等不同層次的研究方法和技術及其在中醫藥科研中的應用，經過六年的教學探索與改革，該門課程已由原來的60學時大幅增加到現在的102學時，增加的課時以實驗課為主，尤其是分子生物學相關的實驗課程。并且該課程由最初的第三學年調整為第五學年授課，以便于學員科研選題設計和學位論文研究開展緊密銜接，學以致用。

Western Blot技術又名蛋白質印跡法、免疫印跡法，是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的方法，可實現對目的蛋白的定性定量及相互作用研究。WesternBlot實驗是蛋白質水平的基本實驗方法，是學員必須掌握的[7]。常規Western Blot實驗通常需要1.5天，受課程安排限制，無法使學員在課堂完成完整的實驗。以往的實驗教學以視頻教學為主，同時觀摩其中個別操作為輔，對于初學者來說，很難理解該實驗的整體面貌，碎片化的實驗操作難以達到課程教學目標。因此，我們通過對教學設計進行調整改革，以最終顯色條帶為檢驗標準的結果驗證導向進行Western Blot的實驗教學，獲得良好效果。

1課前準備工作

由于時間關系，該實驗課聚焦于Western Blot實驗的操作及流程。在課前，教師提前準備好提取的蛋白樣品，經過變性及混入loading buffer后可在課堂上直接用于蛋白電泳。因時間有限，教師可在課前準備好課堂使用的凝膠，在電泳過程中再演示及講解凝膠制備過程。此外，還需要準備與本次實驗相關的儀器及耗材，如電泳液、濕轉液等。

2教學設計

本次實驗課是在前期理論講解WesternBlot的技術原理、操作的主要過程及在中醫藥研究中的應用情況的基礎上進行的，因此，本次實驗課主要進行WesternBlot的實驗操作。常規的Western Blot實驗需要1.5天時間，而本課程在確保步驟完整、結果可驗證的情況下，進行時間的極限壓縮，在4學時內帶領學員完成抗體孵育、顯色及結果反饋，以便于學員理解完整的Western Blot實驗操作及結果呈現形式。具體教學設計如表1。

3實驗設置

在濕轉過程中，操作并講解Western Blot相關試劑的配置方法，包括電泳緩沖液、濕轉緩沖液、TBST等。本實驗采用的封閉液為5%脫脂牛奶緩沖液，按照1g脫脂奶粉加入20 mL1 TBST溶液的比例進行配制并充分混勻。現已有制成品的封閉液、電泳緩沖液、濕轉緩沖液、TBST等，學員只需了解其原理即可，實驗過程中根據具體使用說明書操作。一抗二抗的配制按照抗體說明書的比例，用配制好的5%脫脂牛奶緩沖液進行稀釋。轉膜完成后，根據marker標記出目標蛋白的位置，然后用塑料薄膜將其覆蓋，裁取靶蛋白條帶，放入帶有封閉液的孵育盒中，室溫下搖床上搖動封閉20min。

封閉完成的條帶放入含一抗緩釋液的孵育盒中，室溫條件下搖床上搖動孵育45min。用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5―10min。二抗孵育45min，后用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5―10min，最后進行顯色。由于顯色劑具有光敏性，因此從配顯色劑開始至顯色完成均需注意避光，顯色液應現配現用。顯色的時間應根據蛋白表達豐度決定，可以從短時間開始，如果曝光不理想則適當延長曝光時間，應注意曝光時間短顯色不明顯，同時也要避免曝光時間長，過度曝光占用條帶泳道影響結果解讀。將顯色結果通過班級群向學員反饋，并提出最終實驗結果的解讀及問題分析，指導學生完成實驗記錄。

4學員評價

學員評價分兩部分完成，第一部分是反饋結果并進行結果解讀和問題分析之后，提問學員對整個實驗的理解及感受，當天進行實驗操作的評價，并將其記錄于實驗記錄中。第二部分評價由下次實驗課課前回顧完成，首先通過檢查學員關于Western Blot實驗的記錄本，因所有人均進行了相關的實驗操作，因此從記錄可以看出其真實學習及掌握情況，避免存在隨便抄寫實驗記錄的情況。其次通過提問，Western Blot實驗包括哪些部分，各部分的操作技巧及注意點等，客觀評價學員對該實驗的掌握情況。

5經驗總結

Western Blot是蛋白水平研究的基礎分子生物學實驗之一，也是揭示中醫藥作用的分子機制、促進中醫藥發展的重要手段，是學員必須掌握的實驗研究方法[8-9]。既往的教學多以理論講解技術原理為主，即使是實驗操作課，由于時間的限制，往往只截取其中某一步驟讓學員進行體驗式操作，易造成碎片化理解的劣勢，無法真正為即將進行的學位論文研究打下堅實基礎。以結果驗證為導向的教學方式革新，以最大限度壓縮每個步驟的操作時間，聚焦于讓學員動手操作完成實驗的最多步驟，力求實驗的完整性，并在當天完成實驗結果并進行分析討論，符合記憶特點，便于學員更好掌握。

當然，該實驗方式也存在一些限制，首先受限于實驗儀器及教員數量，為達到最好的教學效果，該實踐教學僅適合于小班課（一般少于20人）。其次，由于大部分實驗步驟進行了時間壓縮，因此在操作間隙要不斷提示學員與常規操作的區別，闡述其中的技術原理，引導學員正確認識。再者，通過結合視頻教學等方式，可以進一步強化學員對Western Blot技術的理解。

*通訊作者：程彬彬

基金項目：海軍院校重點建設教材——《實驗中醫學》。

參考文獻

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