半滑舌鰨源溶藻弧菌的分離鑒定※

●李 彬 彭樹德 白和平 高桂生 史秋梅

（1.秦皇島撫寧區農業農村局 河北 秦皇島 066004；2.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心 河北 唐山 063000；3.唐河縣和杰農業專業合作社 河南 南陽 473000；4.河北科技師范學院 河北 秦皇島 066004）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）屬于弧菌科（Vibrionaseae）、弧菌屬（Vibrio），是一種嗜鹽性、兼性厭氧、革蘭氏陰性短桿菌，是常見的海洋條件致病菌。近年來，水生生物感染溶藻弧菌后主要癥狀為皮膚潰瘍、爛尾、腹水、爛眼等，該病給水產養殖業造成了巨大的損失；人體受傷時容易引起創傷部位感染，誤食容易引起腹瀉，免疫力降低時可引起結膜炎、耳炎、呼吸道感染、血液感染和顱內感染等[1]，因此造成的食源性污染嚴重威脅著人類的生命安全。隨著半滑舌鰨養殖規模的擴大，在養殖過程中各種疾病頻發，溶藻弧菌為重要的病原之一，給半滑舌鰨養殖造成了巨大的危害。

本試驗室于2021年8月對河北省秦皇島市撫寧區某水產養殖場送檢的5條瀕死半滑舌鰨進行了臨床診斷和細菌分離鑒定，以及藥物敏感性敏試驗，以期為溶藻弧菌病的臨床診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

河北省秦皇島市撫寧區某水產養殖場送檢的患皮膚潰瘍病且瀕死的半滑舌鰨5條，體長10～15 cm。

1.2 試劑及儀器

8%綿羊血瓊脂培養基、TCBS瓊脂培養基，購自青島海博生物技術有限公司；DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；抗生素藥敏紙片，購自廣州市益滿生物科技有限公司；ID32E生化鑒定試紙條、ATB全自動生化鑒定儀，購自法國生物梅里埃股份有限公司；革蘭氏染色試劑盒，購自北京博奧闊達生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌的分離純化及形態學觀察 在超凈臺中無菌取潰瘍病灶深部病變組織于1.5 mL EP離心管中，加5倍體積滅菌PBS充分勻漿，離心后用接種環蘸取上清液在血瓊脂平板上均勻涂布，30℃培養24 h后挑取優勢菌純化至菌落形態單一，挑取分離菌劃線于TCBS培養基觀察菌落形態與生長特性；另挑取分離菌進行革蘭氏染色，觀察分離菌染色特性及菌體形態。

1.3.2 分離菌的生化鑒定 用比濁儀調整菌液濃度為0.5麥氏比濁度，使用ID32E生化鑒定試紙卡結合ABI自動生化鑒定儀進行分離菌的生化鑒定試驗，試驗操作及結果判定嚴格按照說明書執行。

1.3.3 抗生素藥敏試驗 采用K-B試紙法進行抗生素藥敏試驗，取100 μL過夜培養的分離菌菌液均勻涂布于TCBS瓊脂培養基，藥敏紙片等間距貼在培養基上，30℃培養箱倒置培養24 h后測量抑菌圈直徑，判斷藥物敏感性。

2 結果與分析

2.1 分離菌的生長特性與形態特征

分離菌在TCBS瓊脂培養基上生長良好，光滑圓潤，為凸起黃色菌落（圖1-A）；在血平板培養基上為大小中等、光滑乳白色的菌落（圖1-B）；經革蘭氏染色，為陰性短桿菌、兩端頓圓，呈散在或成對存在（圖1-C）。

圖1 分離菌的培養及形態特征

2.2 分離菌的生化鑒定結果

經24 h培養的生化鑒定試紙條，用ATB自動生化鑒定儀讀取生化鑒定結果，如表1所示，分離菌生化特性與溶藻弧菌生化特性相似率達96%，符合率較高。

表1 生化鑒定結果

2.3 抗生素藥敏試驗

取培養24 h后的藥敏瓊脂平板測量各種藥物抑菌直徑，結果見表2。分離菌對頭孢曲松、環丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感，對阿米卡星、新霉素、卡那霉素、替米考星中度敏感，對氨芐西林、阿莫西林、多西環素、土霉素、磺胺間甲氧、磺胺鄰二甲氧、復方新諾明耐藥。

表2 抗生素藥敏試驗結果

3 討論與結論

本研究通過對分離菌的生長特性、革蘭氏染色、生化鑒定結果分析，初步鑒定分離菌為溶藻弧菌。在本研究中分離菌生化特性賴氨酸脫羧酶為陽性，與徐曉麗等[2]分離的半滑舌鰨源溶藻弧菌為賴氨酸脫羧酶陰性的結果不同，但與李卓昱等[3]等分離的溶藻弧菌H1B6賴氨酸脫羧酶陽性的結果相同，造成生化特性的差異可能與菌株、儀器、生化鑒定試紙條等因素有關。后續可使用弧菌科專用鑒定試紙條等進一步驗證分離菌的生化特性。通過對分離菌進行抗生素藥敏試驗結果分析，發現分離菌對頭孢曲松、環丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感。臨床生產過程中建議選擇敏感藥物對該病進行預防與治療，但要遵守水產用藥相關法規。