肉蓯蓉葡萄酒釀造關鍵工藝及其體外抗氧化活性

宋晶晶，姜蕾，侯吉超，吳斌，呂澤，張劍林，夏娜*

（1.喀什大學生命與地理科學學院，新疆 喀什 844006；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆理工學院食品科學與工程學院，新疆 阿克蘇 843000）

管花肉蓯蓉為列當科管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa（Schenk）Wight]的干燥帶鱗葉的肉質莖，現代研究表明，人工管花肉蓯蓉含有苯乙醇苷類、環烯醚萜苷類、木脂素類、多糖類、生物堿類等多種生物活性物質，具有增強免疫力、抗疲勞、抗衰老、通便、保肝、壯陽及益智等功效[1-4]，可用于臨床治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等癥[5]。管花肉蓯蓉天然生長于半荒漠和荒漠地區，具有極強的抗旱、抗寒、耐鹽堿特性，主要分布在新疆、甘肅、內蒙古等地，因其功效顯著、長于沙漠被美譽為“沙漠人參”[6-8]。近年肉蓯蓉成為治理荒漠的伴生產物，對肉蓯蓉產業化起到極大的促進作用。紅柳和梭梭樹，作為肉蓯蓉寄主植物，促進了肉蓯蓉的人工種植產業的發展，同時，延長了產業加工鏈、拓寬了經濟附帶產業，經濟價值顯著提高。

我國作為世界上葡萄種植及葡萄酒生產大國，整體產業呈現穩步上升的趨勢[9]。目前，我國葡萄種植面積為1 275 萬hm2，占全球總面積的11.16%[10-11]。新疆具有悠久的葡萄栽培歷史和得天獨厚的氣候條件，2019 年，葡萄栽培面積逐漸擴大到14.33 萬hm2，產量270 萬t；葡萄干產量25.2 t，占我國產量95%以上[12-13]。新疆的葡萄市場處于供過于求的狀態，鮮食葡萄沒有穩定的銷售渠道，致使葡萄大量堆積，造成極大浪費的同時導致了直接的經濟損失。

隨著我國經濟發展，人們的健康保健意識也逐漸增強，開始對養生較為關注，同時，飲食方式也發生了巨大改變，一些功能性食品興起，功能性酒也應運而生，并占據了一定的市場[14-15]。本研究旨在將新疆特色植物肉蓯蓉與鮮食葡萄木納格兩種植物原料中加入專一酵母菌株，經過特定的微生物代謝途徑能使原料中的營養物質更好地保存，并能提高浸提液中的可溶性固形物的提取率，從而提高產品中有效功能性成分的含量，同時轉化為更易被人體吸收、利用的產物[16-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

管花肉蓯蓉、木納格葡萄：市售；酵母菌：喀什大學微生物實驗室。

1.2 儀器與設備

LE2002E/02 電子天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；MJX-160-Z 霉菌培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；LDZX-50KB 型立式蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械有限公司；SXKW 數顯控溫電熱套：北京市永光明醫療儀器廠；RE-52AA 旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；LB32T LB-90T 手持糖度儀：邁德施（上海）分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程：

1.3.2 肉蓯蓉水提物的制備

參考葛繼紅等[19]的提取方法稍作改動，選取品質緊致、色澤淡黃、無變質的干肉蓯蓉。將干肉蓯蓉粉碎過20 目篩網，將肉蓯蓉顆粒與蒸餾水按1∶10（g/mL）的比例提取5 h，在沸水浴條件下回流提取2 次，過100 目濾網，抽濾，濃縮備用。

1.3.3 葡萄汁的制備

去除霉爛及成熟度不一致的葡萄鮮果，分選后，除梗、破碎，經壓榨取汁，低溫（4 ℃）貯藏，備用。

1.3.4 肉蓯蓉葡萄酒的發酵工藝

按一定比例接入酵母菌進行發酵，置于恒溫培養箱中發酵，待發酵液的殘糖量降至4 g/L 時，發酵結束[20]；取上清液，4 000 r/min 條件下離心10 min 后，85 ℃殺菌30 min，得到肉蓯蓉葡萄酒。

1.3.5 肉蓯蓉葡萄酒單因素試驗設計

量取200 mL 原料（肉蓯蓉∶葡萄汁）質量比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 的肉蓯蓉葡萄發酵原液于潔凈的錐形瓶中，考察酵母菌接種量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）、發酵溫度（18、20、22、24、26 ℃）、發酵時間（4、5、6、7、8 d）對發酵結束后測定酒精度及感官評分的影響，重復3 次平行試驗。

1.3.6 肉蓯蓉葡萄發酵液響應面優化試驗

以肉蓯蓉葡萄酒的酒精度（Y1）及感官評分（Y2）為響應值，選取對肉蓯蓉葡萄酒影響較大的3 個因素，酵母接種量（A）、發酵溫度（B）、原料質量比（C）為考察因素，利用響應面軟件Design-Expert.V8.0.6 進行響應面優化試驗設計。響應面的試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 基本指標的測定

1.3.7.1 理化指標

酒精度、干浸出物、總酸、揮發酸、二氧化硫采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法檢測[21]，可溶性固形物采用手持糖度儀測定，pH值采用酸度計測定。

1.3.7.2 微生物指標

菌落總數按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》規定方法進行測定；大腸菌群按照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》規定方法進行測定。

1.3.8 肉蓯蓉葡萄酒的感官評定

由15 名完成《葡萄酒品嘗學》課程的食品專業人員經培訓組成感官評定小組，分別對肉蓯蓉葡萄酒的外觀、色澤、香氣、滋味4 個指標進行感官評價，所有指標分為優、良、中、差4 個等級。要求身體健康且對酒精無過敏性癥狀人員作為感官評定組成員，樣品評鑒完成后用清水漱口，3 min 后評鑒下一個樣品[22]，具體評分標準見表2。

表2 肉蓯蓉葡萄酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation cniteria of Cistanche deserticola wine

1.3.9 體外抗氧化活性測定

1.3.9.1 DPPH 自由基清除能力的測定

DPPH 自由基清除能力的測定參照楊冰鑫等[23]的方法，略作改動。DPPH 自由基清除率計算公式如下。

X=（A0-Ai+Aj）/A0×100

式中：X 為DPPH 自由基清除率，%；A0為空白組的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度；Aj為無水乙醇代替DPPH 溶液時測得對應濃度的吸光度。

1.3.9.2 ABTS+自由基清除能力的測定

ABTS+自由基清除能力的測定參考秦晉穎等[24]的方法，略作改動。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

Y=（A0-Ai）/A0×100

式中：Y 為ABTS+自由基清除率，%；A0為ABTS 溶液與樣品溶劑溶液混合液的吸光度；Ai為待測溶液與ABTS 溶液混合液的吸光度。

1.3.9.3 ·OH 清除能力的測定

·OH 清除能力的測定參照Luo 等[25]的方法，略作改動。·OH 清除率計算公式如下。

Z=（A0-A1+A2）/A0×100

式中：Z 為·OH 清除率，%；A1為37 ℃下反應30 min 后在波長510 nm 處的吸光度；A0為蒸餾水替代樣品為空白對照在510 nm 處的吸光度；A2為蒸餾水替代水楊酸在510 nm 處的吸光度。

1.3.9.4 鐵離子還原能力的測定

參照Kilani 等[26]的測定方法，略作改動，制備鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）工作液，于37 ℃恒溫水浴鍋中貯藏備用。分別取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08 mL 肉蓯蓉葡萄酒于試管中，用純水補充至2 mL，取稀釋好的肉蓯蓉葡萄酒6 μL，加入預熱至37 ℃的FRAP 工作液180 μL、超純水18 μL，避光精確反應5 min，酶標儀測定593 nm 處的吸光度，以雙蒸水為空白對照。

1.4 數據處理

試驗數據通過Origin 85 以及Design-Expert.V8.0.6軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 酵母菌接種量對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響

酵母菌接種量對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響如圖1 所示。

圖1 酵母菌接種量對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由圖1 可知，當酵母菌接種量較少時，肉蓯蓉葡萄酒中的糖不能完全被酵母菌利用轉化，故酒精度較低；當酵母菌接種量較大時，酵母菌會大量生長繁殖消耗發酵液中的糖，用于生成酒精的底物量減少[27]。因此，酵母菌接種量為0.08%時較為合適。

2.1.2 發酵溫度對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響

發酵溫度對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響如圖2 所示。

圖2 發酵溫度對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由圖2 可知，隨發酵溫度升高，微生物新陳代謝越來越旺盛，會較早出現疲勞現象而停止發酵，此后，微生物代謝降低，酒精度隨著發酵溫度的不斷升高呈先上升后下降趨勢，而較低的溫度會使發酵速度減緩，使得發酵時間變長，發酵較為徹底[28]。當溫度達到24 ℃時，酒精度最高，但沒有達到最佳口感。因此，選擇發酵溫度為22 ℃進行后續試驗。

2.1.3 原料質量比肉蓯蓉葡萄酒對酒精度及感官評分的影響

原料質量比對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響如圖3 所示。

圖3 原料質量比對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響Fig.3 Effect of raw-material ratio on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由圖3 可知，肉蓯蓉葡萄酒的原料質量比為1∶5時，酵母自身代謝最快，使得發酵液中糖轉化為酒精的速度最快，酒精度最高，隨著肉蓯蓉比例的增加，發酵液中糖含量升高，可能對發酵過程產生消極的影響愈明顯。當原料質量比為1∶4 時，感官評分達到最大值，因此，選擇原料質量比1∶4 進行后續試驗。

2.1.4 發酵時間對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響

發酵時間對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響如圖4 所示。

圖4 發酵時間對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由圖4 可知，當發酵時間較短時，導致發酵不徹底，糖沒有被酵母充分利用，導致酒體寡淡；當發酵時間過長時，雖發酵徹底，酒精度較高，但口感偏酸，并伴有苦味，還因進入酵母衰亡期使其自溶，致肉蓯蓉葡萄酒口感偏差。因此，發酵時間為7 d 時最合適。

2.2 肉蓯蓉葡萄酒發酵條件的優化

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗的結果，綜合考慮選取以酵母菌接種量（A）、發酵溫度（B）、原料質量比（C）為自變量，以肉蓯蓉葡萄酒的酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，進行三因素三水平試驗，結果如表3～表5 所示。

表3 肉蓯蓉葡萄酒發酵條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Experimental design and analysis of response surface in fermentation conditions of Cistanche deserticola wine

根據肉蓯蓉葡萄酒響應面試驗進行多元回歸方程擬合，建立以肉蓯蓉葡萄酒酒精度和感官評分為評價指標的擬合方程：酒精度Y1= 5.64+0.13A+0.18B+0.22C+0.050AB+0.043AC-0.033BC-0.039A2-0.074B2-0.13C2；感官評分Y2=92.20+1.13A+2.13B+4.25C+1.50AB+0.25AC-0.25BC-4.10A2-2.10B2-4.35C2。

由表4、表5 可知，肉蓯蓉葡萄酒酒精度與感官評分模型回歸方程的相關系數分別為R2=0.991 8、R2=0.984 6，調整復相關系數分別為R2Adj=0.981 3、R2Adj=0.964 8。2 個多元回歸模型P 值＜0.01，說明模型極顯著；多元回歸模型的失擬項P 值＞0.05，說明無失擬因素存在，對模型是有利的。以酒精度為響應值時，模型中A、B、C、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），A2和交互項AB、AC 影響顯著（P＜0.05），由F 檢驗可以得到因子貢獻率為C＞B＞A，即3 個因素對肉蓯蓉葡萄酒酒精度的影響主次順序為C（原料質量比）＞B（發酵溫度）＞A（接種量）。以感官評分為響應值時，模型中B、C、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），A 和交互項AB 影響顯著（P＜0.05），由F 檢驗可以得到因子貢獻率為C＞B＞A，即3 個因素對肉蓯蓉葡萄酒感官評分的影響主次順序為C（原料質量比）＞B（發酵溫度）＞A（接種量）。

表4 以肉蓯蓉葡萄酒酒精度為評價指標響應面試驗結果的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface test based on the alcohol content of Cistanche deserticola wine as an evaluation index

表5 以肉蓯蓉葡萄酒感官評分為評價指標響應面試驗結果的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface test based on the sensory score of Cistanche deserticola wine as an evaluation index

根據肉蓯蓉葡萄酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應面分析圖，結果見圖5。

圖5 各因素交互作用響應面圖Fig.5 Response surface of factor interaction

由圖5 可知，在Y1模型中因素A 與因素B 之間所形成的響應面曲面坡度在兩因素交互作用響應面圖中最為陡峭，即因素A 與因素B 之間的交互作用對肉蓯蓉葡萄酒酒精度的影響最大。在Y2模型中因素A與B 之間所形成的響應面曲面坡度在兩因素交互作用響應面圖中最為陡峭，即因素A 與B 之間其交互作用對肉蓯蓉葡萄酒酒精度的影響最大。

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果為酵母接種量0.06%、發酵溫度25.96 ℃、原料質量比1∶4.12。此優化條件下發酵后的肉蓯蓉葡萄酒酒精度預測值為5.603%vol，感官評分預測值為93.24。為驗證試驗結果的真實性，考慮實際的操作情況，將發酵工藝參數調整為酵母添加量0.06%、發酵溫度26 ℃、原料質量比1∶4，在此發酵工藝條件下，進行3 次驗證試驗，肉蓯蓉葡萄酒的酒精度實際值為5.60%vol，感官評分實際值為93，結果與預測值相差甚微，證明該回歸模型可靠。

2.2.2 基本指標的測定

在最優發酵工藝條件下制備的肉蓯蓉葡萄酒的酒精度為5.60% vol，干浸出物29.64 g/L，總酸6.82 g/L（以酒石酸計），總糖35.72 g/L（以葡萄糖計），大腸菌群≤3 MPN/100 mL，菌落總數≤50 cfu/mL，均符合國家標準的要求。

2.2.3 肉蓯蓉葡萄酒的抗氧化活性

肉蓯蓉葡萄酒的抗氧化活性檢測結果見表6。

表6 肉蓯蓉葡萄酒的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of Cistanche deserticola wine

由表6 可知，肉蓯蓉葡萄酒對DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率及還原能力分別為96.53%、95.64%、96.86%及97.39，有較好的自由基清除能力且有一定的還原能力。許多果實中因含有多酚類物質而表現出抗氧化活性[29]，肉蓯蓉中含有苯乙醇苷類或環烯醚萜苷類、木質素類和多糖類物質，此類物質成分具有一定的抗氧化活性[30]。何夢夢等[31]的研究表明，肉蓯蓉水提物中含有較高濃度的多酚類物質，故其具有很好的抗氧化活性，能有效清除自由基。綜上，肉蓯蓉葡萄酒具有一定的抗氧化活性。

3 結論

采用單因素試驗與響應面設計分析得出肉蓯蓉葡萄酒發酵的最優工藝為酵母菌接種量0.06%、發酵溫度26 ℃、原料質量比1∶4，此條件下得到的酒味清香、肉蓯蓉與葡萄酒氣味均衡，口感純正、酒香愉悅，酒精度5.60%vol，感官評分93。抗氧化活性分析結果表明，其還原能力發酵前后有一定的變化，發酵后的肉蓯蓉葡萄酒DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除率優于發酵前的肉蓯蓉與葡萄汁混合物，肉蓯蓉葡萄酒具有一定的抗氧化作用。肉蓯蓉葡萄酒的研制豐富了新疆葡萄酒品類，為新疆特色植物肉蓯蓉復合酒的產業化奠定基礎。