褪黑素種子引發處理提高朝天椒耐鹽性的作用機制

魏茜雅 秦中維 梁臘梅 林欣琪 李映志

（廣東海洋大學濱海農學院，湛江 524088）

土壤鹽漬化是限制作物生長及產量的重要逆境脅迫之一，全世界約20%的耕地和33%的灌溉農田受到鹽脅迫的影響，預計到2050年，50%以上的耕地面積將出現鹽堿化，嚴重制約著農業的發展［1-2］。鹽漬對植物的傷害主要表現在破壞細胞膜系統，使細胞內離子失去平衡，從而影響植物的生長和發育［3］。研究表明，鹽脅迫能通過阻礙棉花的養分吸收抑制植株生長［4］，鹽害會嚴重破壞辣椒幼苗的生理特性［5］，鹽脅迫會降低辣椒葉片凈光合速率，抑制植株生物量的積累［6］。

種子質量和活力對幼苗的生長和產量的增加起著重要作用，是培育高質量蔬菜的基礎［7］。種子引發技術可以通過修復細胞膜的損傷，提高種子活力和耐脫水力，提高植株生理生化特性來抵御逆境脅迫［8］。研究表明，引發處理后的種子比未引發的種子在發芽和生長過程更有優勢［9］；Gao 等［10］認為通過引發提高種子活力，可以增強植株生長過程中的耐逆性；種子引發技術可以通過刺激發芽過程中的新陳代謝，提高各個生長階段的抗氧化系統來抵御鹽害帶來的壓力［11］。

辣椒（Capsicum annuum）起源于中南美洲，16世紀前后傳入中國，是一種非常古老的栽培植物［12］。辣椒育種目前已由單一目標向多目標育種發展，不僅要求選育品種高產，還要抗多種脅迫［13］。種子引發（seed priming）處理可以促進萌發代謝，從而加速萌發和出苗，并保持較高的出苗一致性，還可以增強種子在脅迫條件下的萌發力［14］。褪黑素（melatonin, MT）是一種天然無毒分子，可作為強有效的內源性抗氧化劑存在于植物體內，其在清除植物體內過量的活性氧、生殖發育、營養吸收和果實成熟等方面具有重要的作用［15-16］。褪黑素最初發現于維管植物中，具有多功能性，可通過影響多種代謝途徑來調節或增強植物抗逆性，緩解重金屬脅迫、干旱脅迫、低溫或高溫逆境對高等植物的損害［17］。Posmyk等［18］通過對紅球甘藍（Brassica oleracea）的研究發現，褪黑素引發能夠消除離子的抑制作用，提高紅球甘藍種子的發芽率。董秋麗等［19］發現，褪黑素能提高干旱脅迫下達烏里胡枝子種子的活力水平。Ko?odziejczyk等［20］發現，褪黑素引發玉米種子可顯著提高玉米抵御低溫脅迫的能力。

褪黑素在提高作物耐鹽性方面發揮著重要作用，但關于褪黑素引發種子對鹽脅迫下辣椒幼苗生長及生理生化代謝的調控鮮有報道。本實驗以‘茂蔬360’為材料，采用不同濃度的褪黑素溶液引發辣椒種子，探究鹽脅迫下辣椒幼苗生長、光合特性、抗氧化能力、滲透調節物質含量和葉、莖、根中K+及Na+含量的變化，以期為減輕鹽脅迫對辣椒生長的抑制作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2022年5月在廣東海洋大學林果樓培養室和南亞熱帶作物研究所避雨棚內進行。供試朝天椒品種為‘茂蔬360’，褪黑素購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 挑選籽粒飽滿的朝天椒種子置于燒杯中，倒入10 mL 濃度為 0（T0）、1（T1）、5（T5）、25（T25）、50（T50）、75（T75）、100（T100）、125（T125）、150（T150）和200（T200）μmol/L的褪黑素溶液避光浸泡12 h，撈出沖洗2-3遍，于25℃的暗室中自然風干至原始含水量。每個處理各60粒，分3次重復。

經褪黑素溶液引發種子后，鹽脅迫下朝天椒根長和地上高度明顯增加，與未引發（CK）相比，100 μmol/L 褪黑素溶液引發處理顯著（P＜0.05）提高了植株根長和地上高度，分別增加69.36%和56.48%；50 μmol/L褪黑素引發處理的根/冠最大，比未引發增加16.18%，差異顯著（P＜0.05）（圖1）。

經不同濃度褪黑素溶液引發種子后，鹽脅迫下朝天椒植株的鮮重、葉片鮮重、莖鮮重和根鮮重都有所提高，與未引發（CK）相比，100 μmol/L褪黑素溶液引發處理最大程度促進了植株鮮重、葉片鮮重和根鮮重，分別增加85.95%、98.23%和48.61%；75 μmol/L的莖鮮重最大，比未引發增加了127.51%，差異顯著（P＜0.05）（圖2）。

1.2.3 葉綠素含量和葉綠素熒光特性分析 葉綠素含量使用SPAD葉綠素儀進行測定，每個處理選擇3株，選取每個葉片葉脈兩側3個位置取平均值。葉綠素熒光參數的測定：將朝天椒植株暗適應30 min后，使用葉綠素熒光儀（FluorPen）測定，每個處理重復3次，選取每個葉片葉脈兩側進行測定。

1.2.4 指標測定 可溶性糖（soluble sugar, SS）含量的測定采用蒽酮比色法［22］；丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法［23］；抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）活性采用Yoshiyμki法測定［24］；可溶性蛋白（soluble protein, SP）含量采用考馬斯亮藍G-520法測定［23］；過氧化物酶（peroxidase, POD）、脯氨酸（proline,Pro）、過氧化氫酶（catalase, CAT）、過氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性和超氧陰離子（superoxide anion,O-）用試劑盒（索萊寶）測定；抗壞血酸（ascor-2bic acid, AsA）和脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate,DHA）活性測定采用分光光度法［25］。

2.4.5 不同濃度褪黑素種子引發處理對朝天椒葉片AsA、DHA和AsA/DHA含量的影響 經100 μmol/L褪黑素溶液引發處理，葉片AsA和DHA含量最大，比未引發增加155.23%、61.85%；濃度為125 μmol/L時，葉片AsA/DHA含量最大，比未引發增加90.03%，差異顯著（P＜0.05）（圖9）。

1.2.5 數據處理 采用 Microsoft Excel 2019 軟件和SPSS 24.0軟件進行統計分析和繪圖，采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗，P＜0.05表示存在顯著性差異。

播種后，分別記載各品種的出苗期，并在出苗后觀察統計各生長階段的生長勢、病蟲害發生情況和倒伏情況；在大麥成熟后，每小區隨機抽選10株進行考種，測量并記載其株高、穗長、小穗數、穗粒數等性狀，同時將每個小區分開，單收、單脫、單計產，并折算產量。試驗數據采用Excel2003和SPSS統計軟件進行分析處理。

2 結果

2.1 褪黑素種子引發處理對鹽脅迫下朝天椒根長、地上高度和根冠比的影響

取引發和未引發（CK）的種子置于墊有3層濾紙的培養皿中，在人工氣候培養箱中催芽（人工氣候培養箱，溫度25℃，光照周期為12 h光照/12 h黑暗，光照強度7 600 lx，相對濕度60%）。種子萌動后，將其播至上直徑12.0 cm、下直徑7.5 cm、高5.5 cm的育苗盆中，栽培基質為椰糠基質，每株一盆，轉移到避雨棚內生長。4-6葉期時進行鹽脅迫處理，每盆澆灌50 mL 100 mmol/L NaCl溶液，每2 d澆灌1次。鹽脅迫處理14 d后，取樣分析。每處理重復3次。

Egger′s檢驗(t=0.39，P=0.708)、Begg′s檢驗(Z=-0.27，P=0.784)和漏斗圖(圖5)的結果均提示，本篇Meta分析不存在發表偏倚。

圖1 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒根長（A）、地上高度（B）和根冠比（C）的影響Fig.1 Effects of seed priming with melatonin（MT）at different concentration on the root length（A）,above ground height（B）and root shoot ratio（C）of C.annuum under salt stress

2.2 褪黑素種子引發處理對鹽脅迫下朝天椒各組織鮮重和干重的影響

1.2.2 形態特征分析 鹽脅迫處理14 d后將朝天椒植株的根系用去離子水清洗干凈后吸干表面水分，用電子天平稱其葉片、莖和根系鮮重，毫米尺測定株高和根長［21-22］。置于105℃烘箱中殺青15 min，80℃下干燥至恒重后，測定植株葉片、莖和根系干重。每個處理重復3次。

2.4.1 不同濃度褪黑素種子引發處理對鹽脅迫下朝天椒葉片丙二醛和ROS含量的影響 經褪黑素溶液引發種子后，鹽脅迫下朝天椒葉片的丙二醛和ROS含量隨著引發液濃度的增加呈現先降低后上升的趨勢，100 μmol/L 褪黑素溶液引發處理時，葉片丙二醛、過氧化氫和超氧陰離子含量最小，比未引發降低63.42%、42.63%、20.94%，差異顯著（P＜0.05）（圖5）。

圖2 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒鮮重（A）、葉片鮮重（B）、莖鮮重（C）和根鮮重（D）的影響Fig.2 Effects of melatonin at different concentration on the plant fresh weight（A）, leaf fresh weight（B）, stem fresh weight（C）and root fresh weight（D）of C.annuum under salt stress

經褪黑素溶液引發種子后，鹽脅迫下朝天椒植株的干重、葉片干重、莖干重和根干重與未引發（CK）相比，75 μmol/L褪黑素溶液引發處理最大程度促進了植株干重、葉片干重和莖干重，分別增加129.29%、136.70%和171.45%；100 μmol/L褪黑素引發處理的根干重最大，比未引發增加85.73%，差異顯著（P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒干重（A）、葉片干重（B）、莖干重（C）和根干重（D）的影響Fig.3 Effects of melatonin at different concentration on the plant dry weight（A）, leaf dry weight（B）, stem dry weight（C）and root dry weight（D）of C.annuum under salt stress

2.3 褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒葉片葉綠素含量和葉綠素熒光特性的影響

2.4.2 不同濃度褪黑素種子引發處理對鹽脅迫下朝天椒葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響 經褪黑素溶液引發種子后，鹽脅迫下朝天椒葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量隨著引發液濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，100 μmol/L褪黑素溶液引發處理時，葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量最大，比未引發增加172.75%、340.40%、256.77%，差異顯著（P＜0.05）（圖6）。

圖4 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒葉片葉綠素熒光參數Fv'/Fm'（A）、Qp（B）、NPQ（C）、Fo（D）、Fv/F0（E）、Fv/Fm（F）和SPAD值（G）影響Fig.4 Chlorophyll fluorescence parameter Fv'/Fm'（A）, Qp（B）, NPQ（C）, Fo（D）, Fv/F0（E）, Fv/Fm（F）and SPAD value（G）in the leaves of C.annuum affected by melatonin at different concentration

2.4 不同濃度褪黑素種子引發處理對鹽脅迫下朝天椒葉片生理特性的影響

1) 在DPST模式中：當原油需長距離運輸時，例如從巴西到中國，會選擇一個中轉點(油庫或錨地)倒油，將原油從DPST轉到常規油船上，由常規油船運輸到目的地；當原油只是短距離運輸時，例如從巴西到美國，沒有轉駁倒油的過程，由DPST直接將原油輸送至目的地(見圖2)。

There was a lack of surgery standardization (there were no clear criteria for splenectomy or spleen-saving dissection of the 10th LN group, instrumental or manual anastomosis, etc.).

另外，對于學生們在實驗中出現實驗失敗、而又無法重新實驗的情況,可在計算機模擬生理實驗中進行操作,重復觀察實驗結果,彌補實驗失敗造成無法觀察實驗現象的不足.另外,對于一些由于課時限制而不能開設的生理學實驗,比如影響家兔動脈血壓因素的實驗,就可以讓學生在模擬實驗中體會各種因素對心臟收縮活動的影響,進一步拓寬學生們的學習范圍.

圖5 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒葉片MDA（A）、過氧化氫（B）和超氧陰離子含量（C）的影響Fig.5 Effects of melatonin at different concentration on the contents of MDA（A）, hydrogen peroxide（B）and superoxide anion（C）in the leaves of C.annuum under salt stress

當褪黑素濃度為100 μmol/L時，FV'/Fm'、Qp、NPQ、Fo、FV/Fm和葉綠素值最大，與未引發相比，分別增加11.15%、10.81%、42.53%、23.90%、1.71%和50.74%，差異顯著（P＜0.05）；75 μmol/L褪黑素引發處理的FV/F0最大，此時與未引發相比，增加了8.01%，差異不顯著（圖4）。

圖6 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒葉片可溶性糖（A）、可溶性蛋白（B）和脯氨酸含量（C）的影響Fig.6 Effects of melatonin at different concentrations on the contents of soluble sugar（A）, soluble protein（B）and proline（C）in the leaves of C.annuum under salt stress

2.4.3 不同濃度褪黑素種子引發處理對朝天椒葉片POD、CAT和SOD活性的影響 經褪黑素溶液引發種子后，鹽脅迫下朝天椒葉片的POD和SOD活性隨著引發液濃度的增加呈拋物線變化趨勢，100 μmol/L褪黑素溶液引發處理，葉片POD和SOD活性最大，比未引發增加142.22%、277.20%；濃度為125 μmol/L時，葉片CAT活性最大，比未引發增加142.91%，差異顯著（P＜0.05）（圖7）。

圖7 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒葉片POD（A）、CAT（B）和SOD（C）活性的影響Fig.7 Effects of melatonin at different concentrations on the POD（A）, CAT（B）and SOD（C）activities in the leaves of C.annuum under salt stress

2.4.4 不同濃度褪黑素種子引發處理對鹽脅迫下朝天椒葉片APX和GR活性的影響 經褪黑素溶液引發種子后，鹽脅迫下朝天椒葉片的APX和GR活性隨著引發液濃度的增加呈拋物線變化趨勢，100 μmol/L 褪黑素溶液引發處理，葉片APX和GR活性最大，比未引發增加212.15%、109.13%，差異顯著（P＜0.05）（圖8）。

圖8 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒葉片APX（A）和GR（B）活性的影響Fig.8 Effects of melatonin at different concentration on the APX（A）and GR（B）activities in the leaves of C.annuum under salt stress

“大麥嶼港區重點發展現代物流業和對臺直航運輸。海門港區以服務臺州主城區生產、生活物資運輸為主?！敝芟閴壅f，而作為臺州的核心港區，頭門港區近期以承接海門港區貨運功能轉移和臨港工業發展為主，遠期發展為集散功能強、臨港工業發達的綜合性港區，“清潔能源、汽車交易中心以及鋼材交易中心等臨港產業，將成為頭門港區的遠期潛力?！?/p>

圖9 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒葉片AsA（A）、DHA（B）和AsA/DHA含量（C）的影響Fig.9 Effects of melatonin different concentrations on the AsA（A）, DHA（B）and AsA/DHA contents（C）in the leaves of C.annuum under salt stress

2.5 不同濃度褪黑素種子引發處理對鹽脅迫下朝天椒植株各器官Na+、K+、Na+/K+離子含量變化的影響

經不同濃度的褪黑素溶液引發種子后，朝天椒植株中根、莖、葉各器官中K+積累量存在顯著差異，主要表現為葉＞莖＞根；Na+積累量差異不顯著；K+/Na+差異顯著，表現為根＞莖＞根。葉、莖、根中K+積累量都在100 μmol/L時值最大，與未引發相比，分別提高了48.45%、58.92%和209.44%，差異顯著（P＜0.05）；Na+積累量都在100 μmol/L時值最小，與未引發相比，分別降低了22.66%、33.36%和11.29%，差異顯著（P＜0.05）； Na+/ K+在100 μmol/L時值最小，與未引發相比，分別降低了48.21%、57.99%和69.34%，差異顯著（P＜0.05）（圖10）。

圖10 不同濃度褪黑素引發對鹽脅迫下朝天椒葉、莖和根系的Na+（A）、K+（B）和Na +/K+（C）含量和比例的影響Fig.10 Melatonin at different concentrations affecting the contents and proportions of Na+（A）, K+（B）and Na+/K+（C）in the leaves, stems and roots of C.annuum under salt stress

3 討論

3.1 褪黑素種子引發處理有助于鹽脅迫下朝天椒植株生物量的積累

鹽脅迫能通過破壞植株內部生理導致系統失調，產生離子毒害抑制農作物正常生長［26］。褪黑素參與調節植物生物量積累和應對多種環境壓力［27］。有研究表明，褪黑素引發棉花種子可以顯著提高植株的耐鹽性［28］；褪黑素種子引發可以打破干旱脅迫對紅花生長的抑制作用，保持植株生長的穩定性［29］。褪黑激素可以有效改善干旱對生物量積累和光合作用的抑制，從而增強幼苗對干旱的適應性［30］；褪黑素浸種可以改善鹽分脅迫下玉米幼苗營養攝取和物質積累的能力［31］。本研究中，75 μmol/L和100 μmol/L褪黑素可以有效緩解鹽脅迫對朝天椒植株生長的壓力，50 μmol/L褪黑素能顯著促進鹽脅迫下根系的發育。

將新鮮荷葉置于恒溫干燥箱中，60 ℃烘干至含水量8%以下，粉碎后過50目篩，密封于干燥自封袋中，置于干燥避光環境中保存。

3.2 褪黑素種子引發處理有效調節鹽脅迫下朝天椒葉片SPAD值及光合系統

葉綠素含量是衡量植物耐鹽性的重要指標之一，葉綠素的喪失通常伴隨著光化學反應的失活，尤其是由PSII介導的光化學反應［32］。葉綠素熒光是研究植物光合作用的有效探針，可以有效地監測植物對逆境的光化學反應機理，從而可以更全面地評價植物的光合作用過程［33］。有研究表明，褪黑素能有效緩解葉綠素的下降速率、抑制葉綠素解體并提高PSII反應中心活性［34］；褪黑素能逆轉熱脅迫降低PSII的實際效率（ΦPSII）、電子傳遞率（ETR）和光化學猝滅系數（qP），并提高植物的脅迫能力［33］。褪黑素引發可以提高低溫弱光脅迫下辣椒葉綠素含量和光合能力，并通過改善光合特性來緩解脅迫［35］。本研究表明，100 μmol/L褪黑素引發種子有效提高了鹽脅迫下辣椒幼苗葉綠素含量，可能與褪黑素有抑制葉綠素降解的作用有關［34］；100 μmol/L褪黑素引發種子時，葉片葉綠素熒光參數PSII光化學活性（FV'/Fm'）、光化學淬滅系數（Qp）、非光化學熒光淬滅系數（NPQ）、初始熒光產量（Fo）和原初光能轉化效率（FV/Fm）顯著提高，說明褪黑素種子引發處理能有效提高植物對光能的利用效率，降低鹽脅迫對朝天椒葉片PSII反應中心的破壞。褪黑素引發后各處理PSII潛在活性（FV/F0）與未引發相比不顯著的原因，可能是朝天椒葉片PSII活性對褪黑素并不敏感，褪黑素種子引發處理只是緩解了鹽脅迫造成的光系統Ⅱ（PSII）損傷。

3.3 褪黑素種子引發處理調控鹽脅迫下朝天椒葉片的生理指標

鹽脅迫下，黃瓜體內由非酶和酶抗氧化劑組成的活性氧清除系統可清除體內過多的活性氧［36］。有研究表明，褪黑素引發紅花種子后，可以提高紅花植株在干旱脅迫中的穩定性并激活抗氧化代謝系統，保護膜結構不受活性氧的損傷，從而提高植株的抗旱性［29］。100 μmol/L 褪黑素溶液進行水稻種子引發，顯著減輕了Cu脅迫對水稻種子的不利影響，褪黑素浸種改善了水稻種子的抗氧化系統，從而減少了銅脅迫誘導的氧化產物的積累［37］。褪黑素引發可以減少黑麥草植株長期脅迫下ROS的積累，并增加抗氧化系統和非抗氧化系統的循環［38］。本研究中，100 μmol/L褪黑素引發種子可以使辣椒植株抗氧化代謝系統增強，最大限度地減少植株中ROS的積累，并保持細胞膜的完整性。

3.4 褪黑素種子引發處理調控鹽脅迫下朝天椒各器官離子含量

氯化鈉（NaCl）引起的鹽度是離子毒性產生的主要原因［39］。Na+是造成植物鹽害的主要離子，會對K+表現出明顯的競爭性抑制作用，影響植物對K+的吸收，導致植物遭受Na+富集毒害與K+虧缺傷害［40］。本研究表明，鹽脅迫處理下，隨著褪黑素溶液濃度的增加，朝天椒植株各器官中K+表現為葉＞莖＞根，說明植株根部到莖部到葉部的離子選擇性運輸能力在褪黑素的作用下逐漸增強。朝天椒植株各器官中Na+積累差異不顯著，說明朝天椒根、莖和葉拒Na+的能力一致，可以保護植株過量吸收Na+。維持植株體內較低的Na+/K+值，是植物適應鹽分脅迫的重要方式之一［40］，朝天椒植株各器官中Na+/K+表現為根＞莖＞葉，且根部Na+/K+比例下降的更劇烈，說明褪黑素種子引發處理對朝天椒根系的影響更大，且植株各組織通過調節Na+/K+來抵抗鹽脅迫［3］。Sezer等［30］研究也表明褪黑素可以通過調節玉米葉片Na+/K+來抵抗鹽脅迫，Yan等［15］也發現褪黑素可以提高水稻根系Na+外排和K+涌入，緩解鹽分對植株的損傷。

4 結論

通過不同濃度的褪黑素引發種子能有效緩解鹽脅迫對辣椒幼苗生長的傷害，以100 μmol/L褪黑素引發時效果最好。褪黑素引發種子能顯著改善辣椒植株光合熒光特性，降低丙二醛、過氧化氫和超氧陰離子含量, 提高抗氧化酶活性和滲透調節物質含量, 提高葉、莖、根中K+含量，降低Na+含量和Na+/ K+，從而提高朝天椒的生長率并抵御土壤鹽堿化對植株造成的損傷，促進鹽脅迫下辣椒植株生長。