寧夏枸杞鐵鎘響應基因的篩選及其功能驗證

余慧 王靜 梁昕昕 辛亞平 周軍 趙會君

（北方民族大學生物科學與工程學院 國家民委黃河流域農牧交錯區生態保護重點實驗室，銀川 750021）

寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）為茄科枸杞屬多年生落葉灌木，其果實枸杞子富含多糖、甜菜堿以及黃酮類化合物，具有滋補肝腎、潤肺明目、抗氧化、抗衰老等功效［1］。寧夏枸杞是寧夏當地典型的經濟樹種，同時也是鹽堿地栽植的先鋒物種之一，在甘肅、青海、新疆、內蒙古和西藏等地也有大面積種植［2］。

鐵元素（Fe）是植物生長發育過程中所必需的微量元素，廣泛參與光合作用、呼吸作用、葉綠素生物合成、活性氧的形成與消除以及氮素的固定等關鍵生理代謝過程［3］，雖然土壤中含有豐富的Fe，但其主要以三價鐵形式存在，植物無法直接吸收利用［4］，尤其西北地區土壤pH普遍偏高［5］，在鹽堿地種植的枸杞往往會出現缺鐵失綠性黃葉病，尤以幼苗和幼樹受害嚴重，這導致幼苗葉綠素合成受阻，含量降低，新葉變黃，生物量大幅度下降［6］。還有研究表明，Fe的缺乏會導致植物過量地吸收鎘（Cd）［7］，Cd是毒性很高的重金屬元素，一般通過農藝措施進入環境，Cd通過Fe和鋅（Zn）轉運蛋白進入植物體內［8］，降低葉綠素的含量以及影響植物體碳的固定從而對植物造成毒害，影響品質［9］。

近年來，FRO、ZIP和NRAMP家族中的一些成員參與了植物細胞內Fe和Cd的吸收和轉運［10-11］。鐵還原酶基因FRO能夠將土壤中的三價鐵轉換成二價鐵。迄今為止，在擬南芥中已克隆出8個鐵還原酶基因AtFRO1-AtFRO8，其中，AtFRO2、AtFRO4及AtFRO5在根系中發揮作用［12-13］，而AtFRO6、AtFRO7及AtFRO8主要在葉片、莖段、花以及果實中高效表達［14-16］。除了擬南芥，豌豆和番茄等植物根系中的重要三價鐵還原酶基因也相繼被克隆。豌豆Fe（Ⅲ）還原酶基因PsFRO1在根及葉中表達，該基因受缺鐵信號誘導而在根表皮高效表達［17］。番茄Fe（Ⅲ）還原酶基因LeFRO1在根、葉、花、果中表達［18］。金屬離子轉運蛋白IRT1是ZIP基因家族中重要的成員，擬南芥的AtIRT1不僅能轉運Fe，而且還能轉運錳（Mn）、鋅（Zn）以及Cd等金屬元素，將AtIRT1敲除后的突變體在缺鐵脅迫下葉片發黃，在苗期致死［19］。缺鐵條件下，水稻OsIRT1和OsIRT2能增強對Cd的攝取和轉運［7］。除了鐵轉運蛋白IRT1能運輸二價鐵離子之外，YSL、NRAMP以及OPT等基因也參與了Fe2+的轉運過程［20］。金屬轉運家族Nramp家族不僅能吸收和轉運Mn、Fe等微量元素，還參與了植物對Cd等重金屬的吸收和轉運［21］，越來越多的研究證實，Fe和Cd共用離子通道［22］。

與其他植物相比，寧夏枸杞中Fe和Cd吸收轉運相關的基因研究較少。本研究通過轉錄組測序技術及生物信息學分析技術，篩選與Fe和Cd吸收轉運相關的關鍵基因，利用實時熒光定量PCR技術結合轉基因酵母技術進行基因功能初步驗證，深入探討目的基因在Fe離子吸收及穩態維持中的作用以及在Cd吸收轉運中的功能，為寧夏枸杞黃葉病的防治、培育高效Fe利用枸杞品種和低鎘累積品種的培育提供理論基礎及技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以寧杞1號組培快繁苗為材料，取生長良好、高度基本一致的組培苗移入Hoagland營養液中進行水培，每7 d更換一次營養液，培養條件為28℃光照16 h/22℃黑暗8 h，光照強度4 000 lx，相對濕度60%-70%。待水培苗生長至10 cm左右時進行處理，用于轉錄組測序及RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 轉錄組測序及與金屬離子吸收轉運相關基因的篩選 選取生長健康、大小一致的枸杞幼苗，以未經Cd處理的枸杞水培苗作為對照，用100 μmol/L的CdCl2處理12 h和48 h后，分別收集對照組和處理組的葉片和根系組織，每個樣品重復取樣3次，液氮速凍后送深圳華大公司進行轉錄組測序。利用GO（Gene Ontology）數據庫和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫進行注釋［23］，挖掘Cd轉運相關功能基因，利用熱圖聚類分析篩選與Cd吸收轉運相關的轉運蛋白基因并進行后期驗證。

1.2.2 枸杞組織RNA的提取及cDNA合成 選取生長健康、長勢基本一致的枸杞幼苗，部分幼苗經200 μmol/L Fe-EDTA處理，于處理后第0、2、8、12、24、48和72 h收集枸杞的根系組織并液氮速凍；剩余部分經100 μmol/L CdCl2處理后第0、8、12、24、48和72小時收集枸杞的根系組織，液氮速凍，用于RNA的提取。取0.1 g枸杞根系組織于液氮中充分研磨成粉末后，利用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒（北京，天根）提取葉片總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以總RNA為模板，用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA（北京，全式金），用作實時熒光定量PCR的模板。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析Fe、Cd脅迫下目的基因表達變化模式 為進一步研究與Fe離子吸收轉運相關的基因在Fe、Cd脅迫下的表達變化情況，篩選了5個相關基因，并使用primer express 3.0軟件設計實時熒光定量引物（表1），采用美國MX3000pTMqPCR實時熒光定量PCR儀，以寧夏枸杞的β-actin作為內參基因［24］，SYBR Green Universal Master mix kit（Toyobo, Osaka, Japan）為熒光染料，模板為稀釋15倍的cDNA，每個樣品設3個重復，反應程序為95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，45個循環。采用2-△△CT法計算基因相對表達量。

表1 基因克隆以及特異性表達分析引物表Table 1 Primers for gene cloning and specific expressions

1.2.4 枸杞中與Fe、Cd吸收轉運相關基因克隆及生物信息學分析 利用常規PCR法，以cDNA為模板，克隆基因全長序列（表1），測序，blast比對并確認。利用在線工具（https://web.expasy.org/protparam/）預測目的基因分子量；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白質跨膜結構域；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測蛋白質的二級結構；利用swiss-model（https:// www.swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質的三級結構；使用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining（鄰接）法構建系統發育樹。

1.2.5 酵母表達載體的構建及轉基因酵母功能分析 所用酵母為Fe敏感型酵母菌株（△CCC1）及Zn/Cd/Ni/Co敏感型酵母菌株（YK44），構建YES2-IRT2、YES2-FRO以及YES2-NRAMP3酵母表達載體并測序驗證。

Fe的敏感型轉化試驗：將Fe敏感型菌株△CCC1接種于YPDGAL液體培養基中進行活化培養，采用醋酸鋰法制備△CCC1酵母感受態細胞，將YES2-IRT2、YES2-FRO、YES2-NRAMP3以及YES2空質粒分別導入△CCC1感受態細胞，在CMUracil和SD+His的篩選培養基上篩選陽性重組酵母菌株并進行PCR驗證。配制含0、400、600和800 μmol/L FeSO4·7H2O的YPD固體培養基。

Cd的敏感型轉化試驗：將Zn/Cd/Ni/Co敏感型酵母菌株（YK44），接種于YPDGAL液體培養基中進行活化培養，采用醋酸鋰法制備YK44酵母感受態細胞，將YES2-IRT2、YES2-FRO、YES2-NRAMP3以及YES2空質粒分別導入YK44感受態細胞，在CM-Uracil和SD+His的篩選培養基上篩選陽性重組酵母菌株并進行PCR驗證，配制含0、40、60和100 μmol/L CdCl2的YPD固體培養基。

將重組酵母菌株接種到YPDGAL液體培養基中，待OD600達到0.5-0.6時停止培養，用滅菌水分別稀釋10-1、10-2、10-3和10-4倍，各取2 μL依次接種于上述含有重金屬的YPD固體培養基中，30℃倒置培養72 h，觀察酵母生長狀況，每個試驗處理重復3次。

2 結果

2.1 轉錄組數據中與金屬離子吸收轉運相關基因的篩選及其注釋

以無Cd脅迫的寧夏枸杞為對照組（CK），以100 μmol/L CdCl2脅迫下的寧夏枸杞為處理組進行轉錄組測序，通過GO和KEGG分析12和48 h的根系和葉片轉錄組數據，設置log2≥2為篩選條件,篩選到大量受Cd誘導而上調表達的基因（圖1、表2），高效響應金屬離子的跨膜轉運蛋白主要包括：ZIP跨膜轉運蛋白家族、NRAMP跨膜轉運蛋白家族、YSL跨膜轉運蛋白家族、OPT跨膜轉運蛋白家族基因等，表明這些跨膜轉運蛋白家族的基因能積極地響應Cd的脅迫，可能具有轉運金屬離子的作用。

圖1 寧夏枸杞根系及葉片中離子跨膜轉運蛋白基因的篩選及熱圖聚類分析Fig.1 Screening and hot map of ion transporter genes in the leaf tissue and root tissue of L.barbarum

表2 根系及葉片中篩選的離子轉運相關基因Table 2 Genes related to ion transporter selected from the root and leaf

2.2 Fe、Cd脅迫下目的基因表達模式分析

基于轉錄組數據分析，篩選5個與跨膜轉運蛋白基因進行Fe、Cd脅迫下的表達模式分析，其在200 μmol/L Fe-EDTA脅迫下的表達倍數（圖2）。IRT1在Fe脅迫8 h時開始上調表達，隨著處理時間的延長而增加，在12 h表達量達到極顯著水平（P＜0.001），在24 h表達量達到最大值，是對照的4.37倍；IRT2在脅迫2 h開始顯著上調表達，在48 h表達倍數達到極顯著水平（P＜0.001），是對照的4.13倍；FRO在Fe脅迫初期表達量略有下降，隨著時間的延長逐漸增加，在72 h時，表達量達到極顯著水平（P＜0.001），為對照的3.28倍；NRAMP3和YSL在Fe脅迫后的72 h時卻呈現極顯著下降水平。結果表明，這些基因在高鐵脅迫下呈現不同的表達變化模式，甚至同一基因在不同的時間點表達倍數有明顯的差異，推測這些基因在枸杞中參與Fe元素的吸收和轉運。

圖2 目的基因在200 μmol/L的Fe-EDTA脅迫下的表達變化模式Fig.2 Expression pattern of target gene under 200 μmol/L Fe-EDTA stress

IRT1在Cd脅迫下8、48及72 h表達倍數達到顯著水平（P＜0.01）；IRT2在Cd脅迫初期表達量并未上調反而有所下降，在第48小時顯著上調表達（P＜0.05），在72 h表達倍數達到極顯著水平（P＜0.001），是對照的5.04倍；FRO的表達量在8 h開始極顯著被抑制（P＜0.001），48 h恢復表達水平；NRAMP3在72 h表達量達到最大值，為對照的6.06倍，YSL為對照的3.26倍（圖3）。結果顯示，FRO受到Cd的負調控，其余的基因都受到Cd的誘導表達，表達倍數有明顯的差異，推測這些基因可能參與了枸杞對Cd的耐受、轉運或解毒。

圖3 目的基因在100 μmol/L的CdCl2脅迫下的表達變化模式Fig.3 Expression pattern of target gene under 100 μmol/L CdCl2 stress

2.3 LbIRT2、LbFRO以及LbNRAMP3的克隆及生物信息學分析

根據實時熒光定量PCR結果篩選了IRT2、FRO及NRAMP3為目的基因進行全長序列的克隆及后期基因功能驗證，利用PCR技術克隆并進行生物信息學分析以及轉基因酵母功能分析。以寧杞1號cDNA為模板，采用常規PCR法，克隆到IRT2、FRO及NRAMP3全長序列，分別為645、2 220和1 533 bp。

通過在線工具預測這3個基因的理化特征（表3），LbIRT2和LbFRO編碼的蛋白理論等電點均大于7，屬于堿性蛋白；LbNRAMP3編碼的蛋白屬于酸性蛋白。LbIRT2編碼的蛋白不穩定指數大于40，屬于不穩定蛋白；而LbFRO和LbNRAMP3編碼的蛋白屬于穩定蛋白。用SOPMA軟件分析蛋白的二級結構，結果（表4）顯示，LbIRT2和LbNRAMP3的α-螺旋含量約占55%，LbFRO蛋白約占37%；其次是無規則卷曲，占20%-30%，β-轉角含量最少。LbFRO和LbNRAMP3三級結構主要由α-螺旋構成，與二級結構預測結果相符合（圖4）。

圖4 LbIRT2、LbFRO及LbNRAMP3跨膜結構、蛋白三級結構以及進化樹分析Fig.4 Transmembrane structure, tertiary structure and phylogenetic tree analysis of LbIRT2, LbFRO and LbNRAMP3 genes

表3 寧夏枸杞中響應鐵鎘脅迫的功能基因理化性質分析Table 3 Physicochemical properties of functional genes responsible to iron and cadmium stress in L.barbarum

表4 寧夏枸杞中響應鐵鎘脅迫的功能基因二級結構預測Table 4 Prediction of secondary structure of functional genes in L.barbarum response to iron and cadmium stress

跨膜結構域預測顯示，LbIRT2具有5個跨膜結構域；LbFRO具有9個跨膜結構域；LbNRAMP3具有11個跨膜結構域，符合NRAMP3家族成員的10-12個典型跨膜螺旋的結構特征。

聚類分析顯示，LbIRT2和玉米以及水稻的IRT1聚為一類，和擬南芥的AtIRT2親緣關系較近；LbFRO和水稻的OsFRO2同源性最高和擬南芥的AtFRO4和AtFRO5處在同一分支；LbNRAMP3與番茄的LeNRAMP3具有較高的相似性，和擬南芥的AtNRAMP3和AtNRAMP4處在同一分支。

2.4 轉基因酵母功能分析

通過分析不同濃度Fe及Cd處理下LbIRT2、LbFRO以及LbNRAMP3的轉基因酵母（圖5）。隨著FeSO4·7H2O濃度的增加，3個轉基因酵母菌株生長狀況要優于對照，在600和800 μmol/L處理下，能明顯觀察到轉化YES2-IRT2、YES2-FRO以及YES2-NRAMP3的酵母菌生長狀況比對照好；在40和60 μmol/L的CdCl2脅迫下，YES2-IRT2和YES2-NRAMP3轉基因酵母的長勢均弱于對照組，在100 μmol/L的CdCl2處理YES2-NRAMP3酵母菌株生長受到極顯著抑制，而YES2-FRO轉基因酵母在CdCl2處理下的生長狀況優于對照組。

圖5 轉基因酵母的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of transgenic yeast

3 討論

大量文獻報道，FRO、ZIP和NRAMP家族中的一些成員參與了植物體內Fe和Cd的吸收轉運過程。鐵還原酶基因（FRO）在植物對Fe元素的吸收上起著重要的作用，能夠將Fe3+還原成Fe2+［25］，使植物能更加容易地吸收鐵元素。Satbhai等［26］利用轉基因技術將AtFRO2導入其他植物體，能夠明顯減輕植物缺鐵黃化癥狀，番茄LeFRO1在葉片中的穩定表達，維持了植物對Fe的吸收利用［27］，杜梨幼苗中與Fe吸收相關基因FRO2和IRT1在缺鐵脅迫下顯著上調表達，增加了對Fe的吸收利用［20］，蘋果屬小金海棠MxFRO4和MxFRO6定位于細胞質膜上，在根、莖、葉中均有表達，受到缺鐵和高鐵脅迫的誘導表達［28］，水稻OsFRO2表達可由鐵過量或持續性缺鐵誘導［29］，這顯示FRO基因受缺鐵或高鐵誘導表達，參與了植物對鐵的吸收利用。本研究所構建的LbFRO系統進化樹顯示，LbFRO和水稻OsFRO2同源性最高，受到高鐵誘導表達，這與Ishimaru等［30］研究結果十分相似，充分證實了FRO基因參與了枸杞中鐵離子的吸收和轉運。同時，該基因的過表達能增強YES2-FRO轉基因酵母對Fe和Cd的耐受性，其機理有待于進一步的研究。

ZIP轉運蛋白家族的基因不僅能夠轉運植物生長所必需的微量元素Zn、Fe、Mn和Cu等，同時還能轉運Cd、鎳（Ni）、鈷（Co）等有毒元素［31］。AtIRT2是最早被發現并克隆到的ZIP家族成員［32］，AtIRT2與AtIRT1有很高的功能相似性，AtIRT2已經被證實定位在細胞內的囊泡上，在根尖受低鐵誘導表達；AtIRT1突變體在環境中無法正常生長，葉片嚴重黃化，幼苗期因缺鐵致死。水稻中的OsIRT1在根、柄和葉中均有表達，過表達OsIRT1基因會提高水稻全株的Fe、Zn含量，并且對高濃度的Cd元素非常敏感，這表明OsIRT1還參與了Zn、Cd的吸收及轉運。本研究轉基因酵母對Fe、Cd的耐性分析表明，在高鐵脅迫下LbIRT2的轉基因酵母長勢比空載體好，由于LbIRT2與定位在囊泡上的AtIRT2同源性較高，推測該基因可以將Fe快速螯合到囊泡中來減少毒害，這種現象被稱為主動適應環境變化［33］；Nakanishi等［7］發現轉化水稻OsIRT1和OsIRT2的酵母菌較表達空載體的酵母對Cd的敏感性更強，通過檢測發現轉OsIRT2酵母細胞中Cd含量顯著高于對照組，大約是對照的1.8倍，表明轉OsIRT1和OsIRT2的酵母菌株累積了過量的Cd而導致對Cd脅迫更加敏感。本研究進化樹分析顯示LbIRT2與OsIRT1同源性較高，同時轉化LbIRT2的酵母生長受到了抑制，這與Nakanishi等［7］的研究結果一致，推測LbIRT2可能參與了枸杞對Fe和Cd的轉運，有待于后期深入研究。

Nramp家族是一類具有轉運金屬離子功能的膜蛋白家族，不僅能轉運Fe和Mn等營養元素，還參與了植物對Cd的吸收和轉運。進化樹分析顯示，LbNRAMP3與番茄的LeNRAMP3基因以及擬南芥的AtNRAMP3親緣關系較近。LeNRAMP3已經被證實定位在囊泡中，在根系中高效表達，在Fe的獲取和再分配中發揮作用［34］；AtNRAMP3定位在液泡膜上，在葉和根中高效表達，在酵母細胞中表達AtNRAMP3和AtNRAMP4能夠提高酵母對Cd的敏感性，通過測定培養24 h后的轉基因酵母中Cd的含量發現，轉AtNRAMP3和AtNRAMP4的酵母中Cd含量顯著高于對照，分別大約是對照的1.8倍和1.7倍［35-38］。本研究進化樹分析顯示，LbNRAMP3與AtNRAMP3和AtNRAMP4序列高度相似，酵母轉化試驗結果顯示，轉化LbNRAMP3的酵母在含40和60 μmol/L CdCl2的培養基上的長勢相對于對照組較弱，在100 μmol/L CdCl2處理的培養基上無法生長，表明轉化LbNRAMP3提高了酵母對Cd的敏感性。同時實時熒光定量PCR發現LbNRAMP3在Fe、Cd脅迫下明顯上調表達，以上研究結果證明了LbNRAMP3參與了Fe和Cd的轉運。

4 結論

從寧夏枸杞中克隆得到LbIRT2、LbFRO以及LbNRAMP3，其受Fe和Cd脅迫后顯著上調表達，酵母中表達LbIRT2、LbFRO以及LbNRAMP3能夠增強酵母對Fe和Cd的敏感性，這3個基因可能參與了枸杞對Fe和Cd的吸收轉運。