雪茄煙葉發酵工藝及其微生物技術研究進展

劉方玉 高強 付沙 李峰 溫亮 劉士峰 劉文濤 杜玉海 范增博 張麗 侯欣

摘要 雪茄煙葉的發酵在整個生產加工過程中至關重要，良好的發酵能有效改善雪茄煙葉的外觀質量、化學成分以及抽吸感官等。分析了雪茄發酵的機制、意義、雪茄煙葉發酵過程中主要化學成分的變化以及雪茄發酵中的微生物及其應用，提出了目前存在的問題，并探討了今后微生物應用發展前景，為微生物技術在雪茄發酵中的應用提供參考。

關鍵詞 雪茄煙葉；發酵機制；化學成分；微生物技術

中圖分類號 TS41+4? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）14-0018-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.005

作者簡介 劉方玉（1999—），女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：煙草栽培與調制。*通信作者，副教授，從事煙草栽培與調制研究。

隨著經濟的不斷發展，新型消費群體迅速發展，雪茄煙消費行為已在國內外主要經濟發展區域和旅游城市逐步出現。近年來，在國家煙草專賣局支持與積極帶動下，經過業界的努力，國內雪茄煙市場不斷保持著較快的發展速度。但總體來說，盡管目前國內的雪茄煙市場都已經成形，但依然處在起步階段，高端國外雪茄煙仍大量充斥著國內市場［ 1］。國產雪茄在品質上還有很大的完善空間。與烤煙煙葉不同，雪茄的煙葉是空氣固化的，這種差異也是雪茄獨特的風味和香氣特征的主要原因，同時這種生產模式下的雪茄煙葉需要另外的步驟來延緩其中的刺激性等不良氣味。發酵是雪茄生產加工中的一大重要步驟，對雪茄的眾多內在品質有著有效提高［ 2］。不同的發酵方法與調控也是每種雪茄獨特風味的獨家技術支撐，其中微生物的應用在發酵過程中也擁有較大潛力，國內外對此都有所研究，部分廠家仍以此作為生產秘方［ 3］。因而更深層次地認識發酵原理，并研究發酵過程中微生物學的動態發展與應用，更好地利用其提升雪茄煙葉的品質至關重要?；诖耍撗芯糠治隽搜┣寻l酵的機制、意義以及雪茄發酵中的微生物及其應用，探討了微生物應用面臨的問題以及發展前景，以期為微生物技術在雪茄發酵中的應用提供參考。

1 雪茄煙葉發酵

雪茄煙葉發酵是指使晾制后的雪茄煙葉發生化學變化和生理變化，改善吸煙質量和加工性能，使其符合工廠加工所需的過程和方法的通稱。

煙草發酵主要分兩種，即自然發酵和人工發酵。自然發酵是指煙葉本身隨著自然氣候條件的變化而發酵。人工發酵是利用適宜煙葉發酵的條件，促進品質轉化，加快煙葉發酵的方法。自然發酵需要很長時間，市場周轉慢，人工發酵更加迎合市場需求。

雪茄煙葉發酵大多分一次發酵、二次發酵［ 2］兩個階段進行，一次發酵是促進煙葉成分的快速變化，主要使煙葉經歷快速生化反應過程；二次發酵主要是彌補一次發酵中的不足，讓煙葉再經歷一次醇化的過程，使煙葉成分更加協調，改善煙葉質量，更好地滿足煙葉的工業需求。雪茄煙葉發酵的具體流程分為回潮、平衡、堆垛、發酵、翻垛、拆垛幾個過程。

1.1 雪茄煙葉發酵機理

實質上，煙草發酵過程是在適宜的溫度濕度條件下，煙草生化特性等品質改變的過程，是工業上常用的加工方法，旨在提高煙葉的內在品質。煙葉發酵原理目前有氧化學說（氧化還原反應、美拉德反應、焦糖化反應）、酶促效應學說和微生物效應學說3種理論?？筛爬椋貉┣寻l酵技術是一種以雪茄煙葉為底物，微生物、酶以及無機元素為催化劑，以發酵技術工藝技術為化學反應要求，以發酵技術后生產的煙葉為產品的生物化學反應過程。

氧化假說主要是由涅斯列爾和什列晉格所提出的，他們都指出煙草中的無機元素在煙草發酵中起催化的功能。即煙葉的發酵過程主要是由這種無機元素作為催化劑來促進，是促使空氣中氧氣氧化的重要過程。微生物假說是由小什列晉格所提出的，認為在煙草發酵中，微生物在早期起了主導作用，在發酵后期則由以無機元素為催化劑的氧化作用下進行［ 4］。酶促作用假說是列夫首先提出的，他還指出，煙葉發酵主要是由于煙草中存在的氧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶等促使發生的酶促作用誘導的。目前普遍認為，煙葉發酵機理是化學氧化作用、酶促作用和微生物作用協同調節的結果［ 5］。

這3種作用對煙葉內在物質產生綜合效應，包括分解掉不具備香味特性的高分子物質，從而合成具備香味特性的小分子結構物質，最終有效改善煙草的抽吸品質等［ 6］。

1.2 雪茄煙葉發酵的意義

發酵過程是決定雪茄成品質量的關鍵制造環節，是調制過程的自然延續。未經發酵的煙葉在品質上會有一些不足，例如外觀上顏色不均勻，甚至含有雜色和青斑；韌性差、易破碎、易霉變。青雜氣重、刺激性大、煙霧粗糙、香氣不足，甚至有苦味、辣味、澀味等不良感受，不能直接用于生產，良好的發酵工藝可以提高煙葉和雪茄的品質。

1.3 雪茄煙葉發酵過程中主要化學成分的變化

煙葉的常規化學成分主要包括總糖、還原糖、鉀、氯、總氮、煙堿等，這些化學成分是調控煙葉發育、調制、發酵等生理活動的主要指標，煙葉的主要化學成分是鑒定煙葉品質的重要指標，同時，還可以通過各成品之間的比重，如鉀氯比、氮堿比、糖堿比等評價煙葉品質［ 7］。這些化學成分含量的協調平衡性也直接影響煙葉的品質。當前，有大量對烤煙煙葉主要化學成分與煙葉品質關系以及生產上的應用的研究，使得當前能夠針對國內烤煙本土情況制定優質烤煙化學成分范圍。雪茄煙葉發酵過程中化學成分的相關研究略欠于烤煙，一方面可能因為雪茄的生產模式更加復雜，尤其發酵方式不同于烤煙，溫濕度的調控變化較煩瑣，單方面的恒溫恒濕狀態下的少量樣品試驗對于實際工業發酵上的指導程度有一定的限制性。另一方面是雪茄發酵的堆垛方式，使其垛中各組分各部位的煙葉狀態以及其中化學成分的含量分布不均勻，測定時對取材的把控與比較有一定難度。

郭文龍等［ 8］將德雪1號的茄芯煙葉進行堆垛發酵，在發酵過程中總糖含量在0.41～0.65范圍內持續下降；還原糖含量在0.04%～0.15%范圍內持續下降；煙堿在0.94%～1.47%范圍內持續增加；氯含量在0.66%～0.87%范圍內持續下降；鉀含量在4.82%～5.42%范圍內，前10天持續增加，10 d后下降；總氮含量在3.77%～4.45%范圍內持續下降。李晶晶等［ 9］在研究發酵條件對雪茄芯葉的影響時，測得傳統雪茄芯葉什煙1號在堆垛過程中煙堿含量為3.13%～3.49%。國外有相關氣相色譜/質譜的研究對古巴和非古的雪茄進行了測定，其中表明非古雪茄的煙堿含量為0.27%～0.28%，古巴雪茄的煙堿含量為0.68%～0.79%［ 10］。

也有相關研究利用恒溫恒濕箱對煙葉進行相對理想狀態的控溫發酵，例如對海南2號茄衣進行發酵，其發酵過程的煙葉總氮含量在整體范圍3%～4%內呈下降的趨勢；總氯在整體范圍1.5%～1.8%內呈下降的趨勢；糖含量在0.70%～0.85%范圍內，整體較少，變化比較穩定；煙堿含量在2.0%～3.5%范圍內，發酵前7天呈增加趨勢，7 d后開始下降；鉀含量在4%～6.5%范圍內，在前14天呈遞減趨勢，14 d后開始增加，在21 d到達最大值后開始下降［ 11］。莫嬌［ 12］在研究中測定了馬杜羅茄衣發酵過程中化學成分含量，結果表示，其發酵過程的煙葉總氮含量在整體范圍3.4%～4.0%內呈持續性下降，前40 d下降速率較快，后40 d下降速率減慢；總氯在整體范圍0.55%～0.95%內呈下降的趨勢；總糖含量在1.39%～2.60%范圍內持續下降；煙堿含量在4.8%～5.2%范圍內，整體呈上升趨勢，前20 d增加速度較快；鉀含量在2.1%～3.4%范圍內持續上升；氯含量在0.52%～0.95%范圍內持續下降，發酵10天內下降速度較緩，之后速率增快。另有試驗在探索顏色參數與煙葉品質相關性的研究中，對恒溫恒濕箱發酵過程中的德雪三號煙葉部分化學成分進行了測定，測定結果表明整個發酵過程中煙葉中的總糖、還原糖、總氮、蛋白質含量逐漸降低，尤其前10天下降較快，發酵結束4者最終含量為0.21、0.06、4.44、9.09 mg/g［ 13］?？傮w來看，雪茄的總糖、還原糖含量普遍較低，其他化學成分如總氮、煙堿、鉀、氯等，因為種質不同、煙葉用途不同、種植和發酵條件不同等因素導致其含量均存在不同程度差異。

2 雪茄發酵中的微生物及應用

2.1 雪茄發酵微生物

在發酵過程中，微生物的動態變化可大致分為時間和空間2個研究路線。時間上主要體現在微生物的數量上，均呈不斷下降的趨勢，在發酵完成時只存余較少的微生物，空間上主要體現在微生物群的種類上，其中細菌尤其是芽孢桿菌等始終是發酵過程中的優勢菌群［ 14］，也可能是因相對高溫高濕的不同發酵環境下，微生物對于溫度和酸堿度的適應程度不同，隨著發酵的進行，少量能夠適應高溫和酸堿度等發酵環境條件的耐熱微生物存活下來。

雪茄煙葉表面微生物群不斷發生著變化。張曉娟［ 3］研究發現，整個發酵過程中，從起始到結束整個過程中，微生物數量減少了90%。這也可能是發酵中的高溫條件消除了大量不耐熱的微生物，只有部分耐熱生物存活下來，并在數量上突出了其優勢。從發酵前的雪茄煙葉中，共分離4個屬的細菌和4個屬的真菌，其中細菌以芽孢桿菌為優勢種，其次為芽孢乳桿菌屬，而真菌則以青霉屬為絕對優勢種。發酵結束后，在發酵作用的煙葉中分離出4屬細菌和3屬真菌。優勢品種仍然是芽孢桿菌和青霉菌，但優勢種減少。隨著發酵的開展，在發酵前24天各種微生物數量都呈現了迅速下降的態勢，24 d以后有少數微生物，大多數微生物數量已下降至0［ 15］。Di Giacomo等［ 16］對意大利托斯卡諾雪茄微生物的群體構造與動態關系進行了深入研究，結果表明發酵過程由復雜的微生物群體共同參與，并在此過程中構造與成分發生改變。在早期階段，中等酸性和中溫環境支持以漢森德巴利酵母為主的酵母種群的快速增長。在這個階段，葡萄球菌科和乳桿菌處于優勢菌群。在環境溫度和pH增高時，形成了內生孢子的革蘭氏陽性球菌（芽孢桿菌屬）數量增多，優勢變得明顯。這會引起pH的進一步上升，從而促進中度耐鹽和嗜酸放線菌在后期階段的繁殖。

眾多研究者對于微生物群落多樣性和豐度也進行了探索。相關研究對海南光村發酵作用的茄衣及表面微生物進行了分離、提純與鑒別，結果表明，細菌菌群為優勢菌群，霉菌比例較小，且未檢測到放線菌與酵母菌，且多為芽孢桿菌［ 17］。張曉娟［ 3］在發酵溫度40 ℃，相對濕度70%的條件下，通過平板分離，研究發酵雪茄外包皮葉面微生物的數量，并在分離發酵生產所含微生物的過程中，探究不同發酵程度與時間的微生物即細菌、放線菌、真菌和酵母菌的數量，結果表明，沒有分離出酵母菌和放線菌，且雪茄煙葉中的菌群以細菌為主。李寧等［ 18］從什邡GH-1雪茄煙葉中分離微生物，發現上部葉煙葉表面帶菌量均多于中部葉及下部葉；張鴿等［ 15］對世界上不同國家雪茄外包皮煙葉表面上微生物差異開展了深入研究，結果發現由于雪茄種植地區的不同，雪茄煙葉表面上的微生物類型也有所不同，總體來看大多是以芽孢桿菌屬為優勢菌群，其次是葡萄球菌，且不同菌株之間的活性也存在著較大差異。

2.2 發酵過程中微生物的作用

發酵不僅是化學反應過程，而且與微生物的酶促作用有關［ 19］，在煙葉老化過程中起著極其重要的作用。

發酵期間微生物作用機理比較復雜，目前已知的首先是由自身代謝，如對糖、蛋白質進行降解，可以改善部分煙葉的香氣，提高雪茄的燃燒性，并降解煙葉中的有害物質［ 20］。同時，其在自身代謝產物中也產生了芳香物質以及致香味物質的前體物和中間物質，能夠用來提高煙葉香味，從而提高煙葉質量。

其次，微生物在生長發育過程中所形成的各種酶類化合物，又或是其代謝產物，它作用于煙草時可誘發或活化煙草內的各種酶系統，進而作用于煙草內的物質（主要為多糖和蛋白質），使底物完全降解，并轉化成為較小分子物質的芳香化合物或各種芳香物質前體物及中間物質，它們都具有提高香味的功效［ 21］。

2.3 煙葉發酵有益微生物的國內外研究

雪茄發酵微生物的研究相對較少，更多地在于對烤煙煙葉的研究，在應用上主要通過施用微生物菌劑以及微生物酶制劑等方式，其目的主要用于降解煙草中有害成分、提升煙草品質［ 6］，也有提高發酵效率［ 22］、抑制煙葉霉變［ 23］等作用。國內外相關研究人員為提高煙葉的內在品質，對煙草發酵過程中的微生物技術進行了相關探究，如對發酵雪茄或者烤煙煙葉表面微生物進行取樣、鑒定、相關生理生化分析等。

2.3.1 降解煙草有害成分有益菌屬。

尼古丁是煙草的一個關鍵有害成分，應用微生物是一種可行的去除尼古丁的方法，Eberhardt等發現生活在煙草環境中的天然細菌和真菌菌株具有降解尼古丁的能力，這些微生物將尼古丁作為生長所需物質來源［ 24］。許多研究已經證明微生物可以降解尼古丁。截至目前，有一些微生物，包括節桿菌屬［ 25-27］、假單胞菌屬［ 28-31］、纖維素單胞菌屬［ 28］、中間蒼白桿菌［ 32-33］、紅球菌屬［ 34］、劍菌屬［ 35］、農桿菌屬［ 36］、米曲霉［ 37］、不動桿菌屬和鞘胺醇單胞菌屬［ 38］被報道具有降解尼古丁的能力。這些微生物通過改變最終產品的煙堿含量和治理煙堿污染，在煙草的制造過程中發揮重要作用［ 39］。

煙草特有亞硝胺是一組只存于煙葉、煙氣中的致癌物質［ 40］。近年來，好氧反硝化菌備受關注并且研究較多，其中，假單胞菌屬內能進行反硝化的種類最多，如銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、施氏假單胞菌［ 41］、綠針假單胞菌、致金假單胞菌、門多薩假單胞菌［ 42］等。另有研究發現，雪茄發酵過程中褪黑素可以降低煙草亞硝胺的含量。褪黑素的特點是通過抑制微生物的亞硝化作用，降低發酵后雪茄煙葉中的亞硝胺［ 43］；Vigliotta等［ 44］發現，漢遜德巴利TOB-Y7酵母能夠耐受非常高的亞硝酸鹽水平并利用亞硝酸鹽，在意大利雪茄發酵過程中可以有效減少亞硝酸鹽和 TSNA 的積累。

2.3.2 提升煙草品質有益菌屬。

煙草發酵過程中的微生物能夠產生多種水解酶，如蛋白酶、果膠酶、淀粉酶等，因此微生物的活動同時主導著物質降解與轉化，這些物質含量的改變也影響著煙葉品質和抽吸感官的變化。

淀粉和纖維素是煙葉的基本成分，煙葉含有50%左右的碳水化合物和5%～15%的蛋白質，碳水化合物中含有約10%～30%淀粉、10%～25%纖維素、12%果膠，這些指標的含量均影響煙葉的品質［ 19］。燃煙時，當煙葉中的成分暴露在燃燒環境中，纖維素會導致刺激性煙霧的釋放，吸煙者會感到口味苦澀。一些涉及煙葉中纖維素熱解產物的研究表明，煙草煙霧中已經鑒定出一些小分子醛和多環芳烴（PAHs），其中PAHs被認為具有致癌性和細胞毒性等毒性性質［ 45］。淀粉在燃煙時也會影響煙葉的燃燒速度和燃燒的完整程度，并且由于淀粉燃燒時會產生不良的焦化氣味而干擾成香反應。同樣，蛋白質在燃燒時也會產生使咽喉嗆咳和不愉快的氣味［ 19］。因此，淀粉、纖維素和蛋白質的適當降解是提高煙葉品質的關鍵。

李志豪等［ 46］發現，蠟樣芽孢桿菌B.cereus對雪茄煙葉中半纖維素及纖維素降解具有一定作用，經菌株發酵后的雪茄煙葉能夠提升葉綠醇、油酸、正二十六烷和正三十一烷等物質的含量；有研究通過煙葉浸提物培養基篩選出一株細菌HD-40，該菌屬于甲基營養型芽孢桿菌，可發酵煙葉產生明顯奶香味，利用該菌株發酵處理煙葉，發現其所含的酯類、醛類、酸類等對香氣有貢獻的成分明顯增加［ 47］。利用氧化酶、果膠酶、纖維素酶等發酵制備雪茄煙葉，經過發酵后，雪茄的苦味得到明顯改善，香氣、煙度、口感、燃燒性和灰色等品質均有所提高［ 48-49］。也有試驗從煙葉中篩選出產香芽孢桿菌并應用于煙葉發酵，發現煙葉中的酯類、醛類、酸類等香氣成分顯著增加［ 50］。將酵母菌和芽孢桿菌應用于煙葉的發酵時，可以降低煙葉淀粉和蛋白質的含量，同時顯著提高煙葉氨基酸和石油醚提取物的含量［ 51］。研究發現，將解淀粉芽孢桿菌GUHP86和GZU03應用于發酵煙葉時，可以發現發酵后煙葉中的芳樟醇、β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮等香氣物質的相對含量增加［ 52］。也有應用于其他發酵過程的微生物，如釀酒酵母應用于煙草發酵可使煙草提取物中的香氣物質較對照增加1倍，其中酮類、酯類、醇類等香氣物質均有不同程度的增加［ 53］。

2.3.3 抑制發酵煙葉霉變有益菌屬。

現有研究大多從導致煙葉霉變的微生物出發，探索主要類群、霉變機理及過程、常見霉菌的生物學特性以及可以應用于防霉的微生物的篩選與進一步探究。研究表明，高地芽孢桿菌YC-9可抑制真菌的生長，還可減少煙葉霉變，將該菌株與貝萊斯芽孢桿菌ACCC02735組合在一起可以提高雪茄發酵外觀品質［ 54］；朱大恒等［ 55］從煙葉表面分離篩選出5株具有抗病性的微生物菌種在抑制霉變方面具有明顯作用。研究表明，一些酵母菌劑對煙葉表面青霉菌、根霉菌的活性有明顯拮抗效果［ 56］；李梅云等［ 57］篩選出部分細菌和酵母菌可誘導宿主產生幾丁酶、葡聚糖酶及其他酶類，這些酶類可以通過分解病原微生物細胞壁，來抑制病原菌生長。

3 展望

關于雪茄發酵過程中微生物的相關探究，國內已有部分研究成果，但總體來說，對比國際優質雪茄煙葉，國內雪茄煙葉品質仍有很大的提升空間。對于雪茄的研究較少，而雪茄的發酵濕度、溫度和持續時間也不同于烤煙，就雪茄發酵機理而言，當前的研究還無法確定3種作用分別對雪茄發酵中的哪一具體方面起主導作用，在整體調控時應如何平衡三者的關系。對于煙草發酵微生物的探究，大多聚焦于煙葉微生物群落及豐度的探索、有益微生物的篩選鑒定以及研究微生物的最優發酵工藝。而對微生物作用機理的分析、將篩選的微生物制成菌劑反施于發酵煙葉、對反施煙葉品質的具體影響等研究較少。同時微生物在發酵上的應用大多還是在實驗室環境條件下的使用效果，應用于生產時，由于環境、發酵方式、雪茄品種的不同，也會有不同的影響因素和限制，有待進一步的研究。

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