植物乳植桿菌發酵復合果汁飲料香氣成分變化過程的分析*

陳馳，吳伯文，楊曉麗，韓金志，周紅艷,*

（1.福建農業職業技術學院，福建 福州 350119；2福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

0 引言

乳酸菌是一類在自然界分布廣泛的益生菌[1]，并作為重要的發酵菌株應用于發酵食品工業。在食品發酵過程之中，乳酸菌可有效改善食品特征風味，并通過代謝產生多種有機酸、寡肽、細菌素、γ-氨基丁酸等生物活性物質[2]，賦予發酵食品改善腸道微生態、提高機體免疫力等生理功效[3-7]；此外，可有效延長產品保質期[8]。《食品安全國家標準 果蔬汁類及其飲料》將發酵果蔬汁飲料定義為把果蔬或者果蔬汁與水作為原料，添加或者不添加其他輔料與食品添加劑制成的食品[9]。乳酸菌在發酵過程中以果蔬汁中的營養物質作為發酵基質，經過分解及合成代謝過程改變底物的物質組成并可賦予產品獨特的風味[10]。

近年來，固相微萃取提取技術與氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）聯用被廣泛應用于食品中香氣成分組成分析[11]；同時，在此分析技術上，結合內標法可進一步對靶向揮發性化合物進行定量分析[12]。該技術可為食品中特征揮發性香氣物質組成及其在生產加工過程中的變化規律分析提供有效途徑。

經乳酸菌發酵可進一步提升復合果汁飲料的風味與營養品質。本文以芒果、哈密瓜復合果汁為基質，選擇食品源植物乳植桿菌為發酵劑，探討在不同發酵階段復合果汁的揮發性氣味物質與感官品質的變化過程。該研究結果可為乳酸菌發酵果汁飲料的產業化開發與產品質量控制提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與試劑

哈密瓜、芒果、純凈水 市售；2-辛醇，分析純，購買于美國Sigma-Aldrich公司；植物乳植桿菌CGMCC 20601來源于福州大學生物科學與工程學院。

1.2 儀器設備

恒溫生化培養箱，SPX-150BIII，黃驊菲斯福實驗儀器有限公司；紫外可見分光光度計，UV-1100型，上海美普達儀器有限公司；分析電子天平，HZKFA2105，美國康州HZ電子科技有限公司；理化分析型超純水機，WP-UP-LH-20，四川沃特爾水處理設備有限公司；高速冷凍離心機，Fresco 17，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；數顯pH計，MP511，上海三信儀表廠；立式高壓滅菌鍋，LDZF-50L-Ⅲ，上海申安醫療器械廠；氣相-色譜質譜聯用儀（GCMS），5977A，美國安捷倫科技有限公司；電磁攪拌器，OMS-181E，上海歐河機械設備有限公司；SPME手動進樣柄，57330-U，美國Supelco公司。固相微萃取萃取頭，PDMS 30um，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復合果汁的制備

將芒果與哈密瓜清洗去皮并切塊，80 ℃漂燙2 min，冷卻榨汁后用紗布過濾，自然澄清，2種水果與純凈水以1∶1∶3的比例進行調配，裝罐密封后115 ℃條件下高壓滅菌20 min，隨之冷卻降至室溫。

1.3.2 菌株接種與恒溫培養[13]

將上述滅菌后復合果汁按體積比0.5%接入植物乳植桿菌生理鹽水菌懸液（OD600為0.5～0.6），37 ℃條件下恒溫靜置發酵，設置3個平行。同時，于0、6、12、24、36、48 h分別取樣置于離心管中并儲存至-20 ℃冰箱待用。

1.3.3 pH值的測定

取約7 mL樣品于10 mL離心管，使用數顯pH計測定發酵復合果汁樣品的pH值，平行取2組，做好標記置于-20 ℃冰箱冷凍保藏，待后續檢測用。取少許發酵好的果汁于燒杯中，以酚酞為指示劑，采用0.1 mol/L的NaOH溶液進行酸堿滴定，計算出酸度。

1.3.4 感官評定

復合果汁經乳植桿菌在不同發酵階段取樣，并依據表1中描述的感官評定標準開展感官品質評定。

表1 耐介質處理前后拉斷力的試驗結果

1.3.5 頂空固相微萃取

將不同發酵時間取得的果汁樣品依據李瑞麗等描述的方法[14]進行頂空固相微萃取操作。首先，取12 mL頂空萃取瓶，取5 mL樣品置于其中，依次加入10 μL濃度為10 mg/mL 2-辛醇（內標）和1 g NaCl，然后置于40 ℃水浴磁力攪拌器上，600 r/min條件下攪拌、溫育20 min，將固相微萃取針插入頂空萃瓶，壓出萃取纖維，并將其固定在距離液面0.5～1.0 cm處，持續溫育、吸附、萃取30 min后收回萃取纖維，拔出萃取針并插入氣相色譜質譜聯用儀中進樣分析。

1.3.6 氣相色譜質譜聯用（GC-MS）分析[15]

對GC-MS分析條件進行設置。首先，將進樣口溫度設定為250 ℃，并選擇DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進行分析；同時，將柱溫箱起始溫度設置為40 ℃，保留8 min，然后以4 ℃/min升溫至150 ℃，隨之以20 ℃/min升溫至250 ℃，并保持恒定溫度5 min。選擇99.999%高純度氦氣作為載氣，并將流速設定為1 mL/min；同時，將離子源溫度設置為230 ℃，電離方式選擇EI，并設置電離能量：70 eV，接口溫度：250 ℃，四級桿溫度：150 ℃；此外，選擇在SCAN模式下進行掃描開展定性分析；同時，離子碎片的掃描范圍為 30～500 m/z，溶劑延遲時間為2.5 min。

1.3.7 揮發性成分的定量分析

選擇匹配度≥85，并采用內標法進行定量分析，根據待測樣品和內標物的峰面積，按照公式⑴計算待測組分在樣品中的含量。

1.3.8 數據處理分析

使用運用Origin 8.5軟件進行繪圖，包括pH值變化分析、熱圖相關制作等；使用SIMCA 14.2軟件進行聚類分析。所分析數據為3次測定的平均值。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間復合果汁pH值變化

乳植桿菌代謝產酸是表明乳植桿菌可適應其生長環境并進行正常繁殖代謝活動的重要指標。由圖1可見，在發酵過程中，pH值呈現逐步下降趨勢，并在發酵36～48 h降至3.5并維持在穩定狀態。在此過程中，植物乳植桿菌可利用果汁中的可發酵糖類作為發酵底物經代謝后生成乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等短鏈脂肪酸，大量有機酸積累導致體系pH值下降。

圖1 復合果汁飲料pH值在發酵過程的變化

2.2 感官評定

香氣、滋味、色澤等感官屬性是評價食品是否具有產業化前景的重要指標。由圖2可見，經植物乳植桿菌發酵，在不同時間段復合果汁的感官評分逐步提升并在發酵36 h時，評分達到最高值95，隨著發酵時間的延長至48 h感官評分略有下降。

圖2 感官評定結果

2.3 不同發酵時間果汁中揮發性物質數量變化

由表2所示，隨著發酵過程的進展，揮發性物質數量呈現逐步增加趨勢，且發酵36 h后由發酵果汁中鑒定出89種揮發性氣味物質，持續發酵至48 h，揮發性氣味物質則下降至79種。乳植桿菌發酵復合果汁中主要的風味物質來自發酵過程中產生的醇、醛、酸、酯、酮等香味物質。其中，在發酵24 h之前，這些風味物質數量及種類都相對較少，復合果汁的香味沒有太明顯的變化；發酵36 h和48 h時檢測到的物質較為豐富，其中以酮類物質為主，如2-壬酮、甲基己基壬酮等。這類物質一般具有水果、藥草、花、柏木等的味道。酚類、醛類、酸類、酯類及酮類均在發酵36 h后達到最高值，分別為15種、12種、8種、16種、10種。

表2 果汁中主要的揮發性物質數量

2.4 不同發酵階段果汁中揮發性氣味物質組成的熱圖分析

復合果汁經乳植桿菌發酵，果汁中的物質組成處于動態變化過程。其中，在不同發酵階段其中的揮發性氣味物質組成亦存在差異。如圖3所示，發酵0 h復合果汁中的揮發性氣味物質以乙酸卞酯、3,4-二甲基苯甲醛、芐醇、對甲基苯乙酮、壬醛、2,4-二叔丁基苯酚和苯乙醇等為主；發酵6 h則以2-甲基丁基乙酸酯、1-己醇、3-蒈烯、二甲基三硫為主；發酵12 h，果汁中出現肉桂醛和反式肉桂醛；發酵24 h時則產生較多乙酸異丁酯；發酵36 h時的主要揮發性氣味物質包括2-壬酮、1-壬醇、乙酸、乙酸己酯、反式肉桂醛、癸醛、2-十三烷酮、1-石竹烯、3-羥基-2-丁酮等；發酵48 h時，2,6,6-三甲基-1-環己烯-1-羧醛、2-壬酮、甲基己基壬酮、葵醛、1-壬醇、2-庚酮等物質成為果汁中的重要揮發性氣味物質。

圖3 發酵復合果汁熱圖

2.5 發酵果汁中揮發性香氣物質主成分分析

將不同發酵階段復合果汁中的揮發性香氣物質進行多元數據分析。聚類分析結果如圖4所示，發酵前期（0 h）的特征揮發性氣味物質較少，發酵6 h主要是2-甲基丁基乙酸酯、1-己醇、蒎烯；發酵12 h主要是肉桂醛和反式肉桂醛；24 h主要是3-羥基-2-丁酮；36 h和48 h的特征化合物明顯有變多，主要包括β-紫羅酮、1-石竹烯、乙酸己酯、甲基壬基甲酮、2-十三烷酮、2-壬酮、苯甲醛、1-辛醇等。

圖4 發酵復合果汁樣本主成分分析

3 結語

近些年，乳酸菌發酵可賦予食品獨特的風味與顯著的益生功能而備受關注。本研究主要探討并詳細闡明了植物乳植桿菌發酵復合果汁在不同發酵階段果汁中主要揮發性氣味物質組成及其變化過程；并同時對不同發酵階段果汁的感官品質進行分析，確定了最佳發酵時間。本研究可為乳酸菌發酵果汁飲料的產業化應用與產品質量控制提供理論參考。