不同佐劑制備的豬偽狂犬基因缺失標(biāo)記滅活疫苗免疫效果的比較研究

李曉艷,李 超,王 巖,喬煜婷,劉 超,齊志濤,楊 波,金 鷹,李化生,陳 堅(jiān),趙麗霞

(金宇保靈生物藥品有限公司,呼和浩特 010100)

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多種家畜和野生動(dòng)物的急性傳染病。PRV屬于A型皰疹病毒亞科豬皰疹病毒Ⅰ型,可感染除人和無(wú)尾猿以外的哺乳動(dòng)物,豬是該病的主要宿主和傳染來(lái)源。PRV呈爆發(fā)性流行,引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎,公豬不育,新生仔豬的大量死亡,育肥豬呼吸困難、增長(zhǎng)停滯等臨床癥狀,是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一[1]。自2011年起,我國(guó)出現(xiàn)毒力增強(qiáng)的偽狂犬變異毒株,給中國(guó)生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。國(guó)內(nèi)多家單位對(duì)變異PRV的單基因或多基因缺失疫苗進(jìn)行大量的研究,這些基因缺失苗均可有效保護(hù)變異PRV對(duì)豬群的侵襲,但仍無(wú)法提供完全的保護(hù),或存在安全性不足的問(wèn)題。因此開(kāi)發(fā)和制備安全性及免疫效果更好的豬偽狂犬基因缺失滅活疫苗,對(duì)于預(yù)防豬偽狂犬病和有效控制偽狂犬疫情具有重要意義。

毒株的選擇是預(yù)防疾病的關(guān)鍵,優(yōu)質(zhì)的佐劑是疫苗質(zhì)量穩(wěn)定的保障,為提升疫苗免疫效果,本試驗(yàn)利用成功構(gòu)建的PRV變異弱毒株(JS2012ΔgE株)開(kāi)展了豬偽狂犬病滅活疫苗的研制工作,并對(duì)不同劑型佐劑進(jìn)行了篩選研究。

1 材 料

1.1 主要試驗(yàn)材料 PRV(JS-2012△gE株)滅活抗原液,批號(hào)2022005,病毒含量108.0TCID50/mL;用于做細(xì)胞中和試驗(yàn)的PRV病毒液(JS-2012△gE株),F7,批號(hào)210709,病毒含量107.5TCID50/mL;BHK21 細(xì)胞(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)、PRV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清,均由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室制備保存;水包油包水佐劑(ISA206)、水包油佐劑(ISA28VG)、水佐劑(Gel02)和油包水佐劑(ISA70VG),購(gòu)自法國(guó)SEPPIC公司;PRV gB ELISA抗體檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自IDEXX公司。

1.2 主要試驗(yàn)動(dòng)物 30 日齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價(jià)不高于1∶4 或血清gB ELISA抗體檢測(cè)陰性,且PRV抗原檢測(cè)陰性)25頭,購(gòu)自呼和浩特市土默特左旗國(guó)營(yíng)種豬場(chǎng);3～5 周齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價(jià)不高于1∶4 或血清gB抗體ELISA檢測(cè)陰性,且PRV抗原檢測(cè)陰性)共計(jì)55頭,購(gòu)自呼和浩特市土默特左旗國(guó)營(yíng)種豬場(chǎng)。

2 方 法

2.1 疫苗配制 取PRV純化濃縮滅活抗原液632 mL,平均分為4份,按照表1 中組分含量分別稱取ISA206 佐劑、ISA28VG佐劑、Gel02佐劑、ISA70VG佐劑,在28 ℃環(huán)境下將4 份水相分別緩慢加入4 份佐劑中,ISA206、ISA28VG、Gel02三組以400 r/min勻速攪拌10 min,ISA70VG組以10000 r/min勻速剪切15 min,以上各組疫苗2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 疫苗組別Tab 1 Vaccine groups

2.2 仔豬安全性檢驗(yàn) 用30 日齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價(jià)不高于1∶4或血清gB ELISA抗體檢測(cè)陰性,且PRV抗原檢測(cè)陰性)25頭,隨機(jī)分為5組,每組5頭,1～4組分別耳后肌肉免疫ISA206、ISA28VG、Gel02、ISA70VG疫苗,單側(cè)耳根后肌肉單點(diǎn)注射疫苗6 mL,5組為對(duì)照組不免疫,逐日觀察10 d并監(jiān)測(cè)體溫,觀察免疫豬是否出現(xiàn)偽狂犬癥狀或明顯的局部和全身不良反應(yīng)或因注射疫苗引起的死亡。

2.3 中和抗體監(jiān)測(cè) 用3～5 周齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價(jià)不高于1∶4或血清gB ELISA抗體檢測(cè)陰性,且PRV抗原檢測(cè)陰性)25頭,隨機(jī)分為5組,每組5頭,1～4組分別耳后肌肉免疫ISA206、ISA28VG、Gel02、ISA70VG疫苗,2 mL頭,5組為陰性對(duì)照組不免疫,一免后21 d以同樣劑量、同樣接種方法加強(qiáng)免疫一次,陰性對(duì)照組不免疫。分別于免前、一免21 d、二免28 d、二免60 d、二免90 d、二免120 d采血,進(jìn)行細(xì)胞中和抗體監(jiān)測(cè)。

2.4 仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn) 用3～5 周齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價(jià)不高于1∶4或血清gB ELISA抗體檢測(cè)陰性,且PRV抗原檢測(cè)陰性)30頭,隨機(jī)分為6組,每組5頭,1～4組分別耳后肌肉免疫ISA206、ISA28VG、Gel02、ISA70VG疫苗,2 mL/頭,5組為感染對(duì)照組不免疫,6組為陰性對(duì)照組不免疫不攻毒,一免后21 d以同樣劑量、同樣接種方法加強(qiáng)免疫一次,感染對(duì)照組及陰性對(duì)照組不免疫。二免后7 d連同感染對(duì)照組進(jìn)行攻毒,每頭豬滴鼻JS2012株檢驗(yàn)毒2 mL(病毒含量為106.00TCID50/mL),攻毒后連續(xù)觀察14 d,每日監(jiān)測(cè)體溫,并采集免疫組和對(duì)照組的鼻拭子和肛拭子監(jiān)測(cè)排毒情況。

2.5 臨床及組織病理變化觀察 攻毒后觀察試驗(yàn)豬食欲、精神狀態(tài),是否出現(xiàn)由豬偽狂犬病病毒引起咳嗽、喘氣、張嘴呼吸、腹式呼吸等呼吸道癥狀以及共濟(jì)失調(diào)、麻痹、四肢亂劃、角弓反張等神經(jīng)癥狀,同時(shí)對(duì)攻毒試驗(yàn)中發(fā)病死亡或試驗(yàn)結(jié)束迫殺的仔豬,進(jìn)行病理剖檢。取腦、肺臟、脾臟、肝臟等組織進(jìn)行眼觀病變觀察并拍照。

3 結(jié)果與分析

3.1 理化檢驗(yàn)結(jié)果 4組偽狂犬滅活疫苗理化檢驗(yàn)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):ISA206組疫苗滴入水中,呈云霧狀擴(kuò)散現(xiàn)象,為水包油包水型;ISA28VG組疫苗滴入水中,呈快速擴(kuò)散現(xiàn)象,為水包油型;Gel02組疫苗滴入水中,完全溶解于水中;ISA70VG組疫苗滴入水中,呈油滴狀不擴(kuò)散,為油包水型;穩(wěn)定性檢測(cè)均未出現(xiàn)分層;黏度分別為29.8 cP、13.6 cP、3.2 cP、42.7 cP,全部符合標(biāo)準(zhǔn),詳見(jiàn)表2。

表2 4組偽狂犬滅活疫苗理化檢驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The physical and chemical test results of 4 groups of PRV inactivated vaccines

3.2 仔豬安全性檢驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)采用3 倍免疫劑量(6 mL/頭)對(duì)易感仔豬進(jìn)行安全性檢驗(yàn),將制備的4組滅活疫苗肌肉注射仔豬,連同對(duì)照組觀察10 d并監(jiān)測(cè)體溫。結(jié)果顯示,ISA70VG組免后6 h至免后第2 d體溫升高至41 ℃,免后第3 d體溫恢復(fù)至正常,ISA206組免后6 h至免后第1 d體溫升高至40.5 ℃,ISA28VG組和Gel02組免后體溫正常,4組疫苗均未見(jiàn)疫苗引起的全身或局部不良反應(yīng),注射部位均未見(jiàn)紅、腫、熱等反應(yīng),仔豬發(fā)育良好,精神和食欲均正常。由此可見(jiàn),ISA70VG因其油包水的劑型,刺激性稍大,引起短暫的體溫升高,而ISA28VG和Gel02佐劑無(wú)免疫副反應(yīng),不引起體溫升高,ISA206佐劑僅引起較小的體溫變化,隔日恢復(fù)正常,不影響采食活動(dòng)。體溫監(jiān)測(cè)見(jiàn)圖1。

圖1 體溫監(jiān)測(cè)結(jié)果Fig 1 Temperature monitoring results

3.3 仔豬中和抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果 將4 種疫苗免疫仔豬后,于一免21 d、二免28 d、二免60 d、二免90 d、二免120 d、二免150 d對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物采血并分離血清,用細(xì)胞中和試驗(yàn)測(cè)定中和抗體。陰性對(duì)照組中和抗體滴度<1∶21,免疫組抗體消長(zhǎng)規(guī)律相似,一免21 d各免疫組抗體滴度無(wú)顯著性差異,均≤1∶26.5,二免后呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì),二免28 d至二免60 d達(dá)到最高值,二免90 d各免疫組抗體開(kāi)始緩慢下降,ISA70VG組二免后各時(shí)間段中和抗體滴度顯著高于其它免疫組(P<0.05,P<0.001),其最高值可達(dá)1∶210,其次是ISA206、ISA28VG、Gel02組,抗體值分別為1∶29、1∶29、1∶28,ISA70VG組抗體下降速度最慢,二免150 d,ISA70VG組抗體維持在1∶26～1∶27.5,ISA206組抗體維持在1∶24.5～1∶26,ISA28VG組及Gel02組抗體下降至1∶24.5和1∶23.5。試驗(yàn)結(jié)果提示:油包水型(ISA70VG)疫苗在體內(nèi)的緩釋作用使抗體產(chǎn)生更高且持續(xù)期更長(zhǎng);水包油型(ISA28VG)疫苗及水佐劑型(Gel02)疫苗釋放抗原快,抗體值較低且持續(xù)期短;水包油包水型(ISA206)疫苗緩釋作用鑒于ISA70VG與ISA28VG之間。4 種疫苗免疫架子豬中和抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 中和抗體結(jié)果Fig 2 Neutralization antibody results

3.4 仔豬攻毒保護(hù)結(jié)果 4組疫苗連同感染對(duì)照組于二免第7 d攻毒。攻毒結(jié)果:感染對(duì)照組攻毒后第2 d,5/5頭出現(xiàn)持續(xù)性體溫升高,并伴有典型的豬偽狂犬臨床癥狀,表現(xiàn)為精神沉郁、厭食、拉稀、呼吸困難,共濟(jì)失調(diào)并伴隨神經(jīng)癥狀,同時(shí)在攻毒后第6 d與第11 d出現(xiàn)死亡病例,死亡率為40%,免疫組除Gel02和ISA28VG各3/5頭出現(xiàn)持續(xù)性體溫升高的癥狀外,均未出現(xiàn)因豬偽狂犬病引起的臨床癥狀,4個(gè)免疫組均100%保護(hù),存活率100%。攻毒后體溫與存活率見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 攻毒后體溫監(jiān)測(cè)結(jié)果Fig 3 Temperature monitoring results after challenge

圖4 攻毒后各組豬存活情況Fig 4 Survival of piglets post challenged

3.5 仔豬攻毒后排毒結(jié)果 攻毒后第1 d至第14 d,檢測(cè)各免疫組及對(duì)照組鼻拭子和肛拭子排毒結(jié)果,感染對(duì)照組5/5頭持續(xù)排毒,排毒量最高,平均達(dá)106copies/mL,顯著高于免疫組(P<0.001),并于攻毒后第4～7 d,達(dá)到峰值;各免疫組較對(duì)照組排毒時(shí)間短,排毒量少;其中排毒時(shí)間最長(zhǎng)且排毒量較高的組別是Gel02組,累計(jì)排毒10 d,平均排毒量為104.1copies/mL,ISA28VG組次之,累計(jì)排毒9 d,平均排毒量為103.1copies/mL,ISA206組累計(jì)排毒7 d,平均排毒量為102.2copies/mL,ISA70VG組累計(jì)排毒4 d,平均排毒量達(dá)102.0copies/mL;攻毒后14 d內(nèi),感染對(duì)照組仔豬的排毒量及排毒時(shí)間比其他各免疫組仔豬的排毒量高且時(shí)間長(zhǎng),ISA206組和ISA70VG組仔豬的排毒量相似且最低,ISA28VG組及Gel02組仔豬的排毒時(shí)間及排毒量均高于前兩組。進(jìn)一步證明ISA70VG 佐劑和ISA206佐劑能更好地抑制試驗(yàn)豬的排毒,降低PRV病毒感染風(fēng)險(xiǎn)。具體見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 QPCR檢測(cè)鼻拭子排毒情況Fig 5 QPCR detection of nasal swab detoxification result

圖6 QPCR檢測(cè)肛拭子排毒情況Fig 6 QPCR detection of anal swab detoxification result

3.6 臨床及組織病理變化觀察 對(duì)攻毒試驗(yàn)中發(fā)病死亡或試驗(yàn)結(jié)束迫殺的仔豬,進(jìn)行病理剖檢。取腦、肺臟、脾臟、肝臟等組織進(jìn)行眼觀病變觀察并拍照。感染對(duì)照組病死或最終存活的仔豬大都體型消瘦且被毛粗亂,剖檢見(jiàn)腦脊液明顯增多,腦充血嚴(yán)重;肺部氣腫,并伴有出血、壞死、肉實(shí)變等;脾臟可見(jiàn)針狀出血點(diǎn),壞死嚴(yán)重;肝臟邊緣淤血壞死等癥狀。ISA206組和ISA70VG組剖檢以上組織,均未見(jiàn)明顯眼觀病理變化;ISA28VG組和Gel02組2頭實(shí)驗(yàn)豬解剖后肺部出現(xiàn)輕微的實(shí)變和出血點(diǎn),脾臟有輕微出血點(diǎn),腦組織輕微充血,其他組織均未見(jiàn)明顯眼觀病理變化。從病理變化結(jié)果進(jìn)一步證明ISA70VG 佐劑組和ISA206佐劑組攻毒后無(wú)病理變化,優(yōu)于其他兩組。具本見(jiàn)圖7。

圖7 攻毒豬剖解的眼觀病變Fig 7 The autopsy lesions of piglets against poison

4 討 論

目前,國(guó)內(nèi)使用的豬偽狂犬疫苗主要有滅活苗、弱毒苗和基因缺失苗,這些疫苗對(duì)偽狂犬病的防控起到了一定作用。滅活苗在使用上較為安全,但也存在其抗原成分含量較低、接種劑量大和免疫效率低的缺陷,弱毒苗的免疫效果較好,價(jià)格低廉,但是存在毒株毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn),甚至弱毒苗會(huì)引發(fā)豬群潛伏感染[4],基因缺失疫苗不僅安全有效而且能夠區(qū)分免疫接種豬和野毒感染豬,為該病的控制與凈化提供了有效的手段。為了更好地提高豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性,增強(qiáng)滅活疫苗對(duì)豬只的免疫效果[5-6],本文篩選出4 種有代表性的佐劑,制備豬偽狂犬基因缺失標(biāo)記滅活疫苗(JS2012ΔgE株),從疫苗的穩(wěn)定性、黏度、安全性、效力、攻毒保護(hù)五個(gè)方面評(píng)價(jià),篩選出ISA70VG及ISA206可作為制備豬偽狂犬基因缺失標(biāo)記滅活疫苗(JS2012ΔgE株)最理想的佐劑。

本研究篩選和評(píng)價(jià)佐劑的標(biāo)準(zhǔn)是:黏度低,易于注射;免疫刺激小,無(wú)不良反應(yīng);免疫效果好,攻毒保護(hù)率100%,且免疫持續(xù)期長(zhǎng)。按照該標(biāo)準(zhǔn)初步篩選到兩款佐劑,為進(jìn)一步研究豬偽狂犬滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。其中ISA70VG免疫效果最好,其次是ISA206佐劑,兩種佐劑均為礦物油佐劑,前者為油包水劑型,后者是水包油包水劑型,兩者共性是均能形成油包水乳液包裹抗原,保護(hù)抗原使其不被機(jī)體中的酶類物質(zhì)快速分解,并且油包水乳劑在注射部位貯存時(shí)間長(zhǎng),不能在短時(shí)間內(nèi)全部吸收代謝,因此也能延長(zhǎng)其包裹的抗原在機(jī)體內(nèi)的貯存時(shí)間,持續(xù)刺激機(jī)體,促使巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的聚集和增殖,提升免疫效果,兩者不同之處是ISA70VG全部形成油包水乳液,ISA206佐劑有一半形成水包油乳液,該乳液與油包水乳液相比,因外層是水相,對(duì)機(jī)體的刺激作用明顯減弱,因此,ISA206佐劑在免疫效果上略遜色于ISA70VG,其他理化及安全性結(jié)果兩者相似。ISA28VG及Gel02 因其為水包油和水佐劑,外層均為水相,與油相相比,對(duì)機(jī)體的刺激效果較弱,且水相成分快速被機(jī)體中的酶類物質(zhì)分解而降低了免疫持續(xù)期效果。

綜合以上結(jié)果,篩選的4 種不同佐劑制備的豬偽狂犬滅活疫苗(JS2012ΔgE株)對(duì)斷奶仔豬均能提供有效的保護(hù),但I(xiàn)SA 206和ISA70VG更適合作為研制豬偽狂犬滅活疫苗(JS2012ΔgE株)的佐劑。