雙黃連制劑及其藥物組成對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌體外抑菌效果研究進(jìn)展

彭文繡,韓寧寧,戴 青,龔旭昊,張秀英

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

大腸桿菌為革蘭氏陰性短桿菌,是人和動(dòng)物腸道中的正常寄居菌。在一定條件下,一些血清型的大腸桿菌能引起一系列的感染,具有發(fā)病急、發(fā)病范圍廣、一年四季均可發(fā)病等特點(diǎn),易導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥,甚至引起死亡,給畜禽業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[1-3]。金黃色葡萄球菌是目前最常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性球菌[4],主要在人與動(dòng)物的皮膚、呼吸道和消化道黏膜、癤、癰以及化膿創(chuàng)口中寄居,可引發(fā)肺炎、偽膜性腸炎、心包炎和敗血癥、膿毒癥等全身感染[5]。獸醫(yī)臨床上主要應(yīng)用喹諾酮類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類等廣譜抗菌藥物治療金黃色葡萄球菌或大腸桿菌病。然而,隨著抗菌藥的長(zhǎng)期和廣泛使用,細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重,不僅給這些疾病的防治帶來(lái)困難,且殘留的藥物還將危害消費(fèi)者健康[6]。因此,開(kāi)發(fā)抗菌藥物替代品是當(dāng)前新藥研制的熱點(diǎn)之一。

中草藥用于疾病防治歷史悠久,其具有資源豐富,價(jià)廉易得,安全無(wú)殘留,不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn),已成為當(dāng)前尋找抗生素替代品的重要來(lái)源。其中,清熱解毒藥具有清里熱、涼血解毒的功效,可以抗菌、消炎、抗病毒、提升免疫力,在臨床上應(yīng)用范圍非常廣泛[7]。雙黃連為清熱解毒藥物中的一種,它是由黃芩、金銀花與連翹三味中藥組成,因價(jià)格適宜、療效好、不良反應(yīng)相對(duì)較小等特點(diǎn),常被用來(lái)治療外感風(fēng)寒所致的上呼吸道感染、急性支氣管炎、肺炎和急性扁桃體炎[8]。為進(jìn)一步了解雙黃連制劑及其藥物組成對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各自的藥理作用及抑菌效果,本文將從藥理作用機(jī)制、體外抑菌效果研究及影響藥物體外抗菌活性的因素等方面進(jìn)行綜述,以期為后續(xù)研究工作的深入開(kāi)展、獸醫(yī)臨床合理選擇和使用藥物提供參考。

1 藥理作用機(jī)制

雙黃連制劑組方中各單味藥材的化學(xué)成分較為復(fù)雜,有研究表明[8],黃芩中含有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等有效成分,對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌等,均有顯著的體內(nèi)外抗菌作用。綠原酸是金銀花中含量最多的活性成分,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的抑制作用[9-11]。連翹的主要藥效成分之一為連翹苷,具有多種生物學(xué)活性,可明顯抑制銅綠假單胞菌、葡萄球菌等[9-11],在臨床上使用具有清熱解毒、散結(jié)消腫的功效。

這些藥物具體的抗菌作用機(jī)制可能包括以下幾個(gè)方面:直接破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、干擾機(jī)體細(xì)菌生物膜的形成過(guò)程,抑制微生物酶的活性,降低內(nèi)毒素的同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體免疫和防御功能。周志娥等[12]以大腸桿菌為研究對(duì)象,初步闡明了綠原酸、異綠原酸 A 可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),增加其通透性,使細(xì)胞內(nèi)容物外泄以起到抑菌作用。Chen Y等發(fā)現(xiàn)[13]黃芩苷可通過(guò)控制轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因和 ICA 基因的表達(dá)抑制金黃色葡萄球菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)。這說(shuō)明黃芩苷的抗菌作用就是通過(guò)破壞細(xì)菌生物膜而實(shí)現(xiàn)的。陳璐等[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出黃芩苷能夠降低質(zhì)粒 pSD11 在宿主大腸桿菌中的穩(wěn)定性,影響質(zhì)粒介導(dǎo)的多重耐藥基因的水平傳播,進(jìn)而消除細(xì)菌耐藥性。改變細(xì)胞壁、細(xì)胞膜通透性是導(dǎo)致菌體內(nèi)蛋白質(zhì)和質(zhì)粒等大分子逸出的機(jī)制之一。彭璐媛[15]發(fā)現(xiàn),黃芩苷對(duì)雞大腸桿菌病具有預(yù)防作用。具體機(jī)制為黃芩苷通過(guò)恢復(fù)禽致病性大腸桿菌感染誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂,增加腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸細(xì)菌的豐度,促進(jìn)腸道短鏈脂肪酸,尤其是乙酸的產(chǎn)生。高濃度的短鏈脂肪酸(特別是乙酸)從腸道遷移至肺臟,可抑制禽致病性大腸桿菌引起的肺臟炎性損傷并維持氣血屏障的完整性,最終發(fā)揮抗大腸桿菌病的作用。程廣東[16]認(rèn)為作為連翹的主要有效成分之一,連翹酯苷A可提高機(jī)體谷胱甘肽、總超氧化物歧化酶活性及抗氧化酶活力,降低自由基丙二醛含量,激活雞體免疫系統(tǒng),以起到抗氧化和抗炎功效。另有研究證實(shí)[17],連翹在亞抑菌濃度下還對(duì)R質(zhì)粒具有消除作用。

2 體外抑菌效果研究

范國(guó)英等[18]將8種單味中藥經(jīng)水煮處理成1 g/mL的受試溶液,對(duì)從豬糞便、腸內(nèi)容物中分離的致病性大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),黃芩水提液最小抑菌濃度為0.0286 g/mL。王雅如等[19]選取包含金銀花在內(nèi)的10 種中草藥,采用水煎法和醇提法兩種方法制成濃度均為1 g/mL的藥液,利用紙片瓊脂擴(kuò)散法、二倍試管稀釋法分別測(cè)定這10種中藥的兩種提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度,其中金銀花水提取物、醇提取物對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為 250.00 mg/mL和500.00 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌則分別為125.00 mg/mL和250.00 mg/mL。王帥兵等[3]選取黃芩、連翹和金銀花等8種中藥分別進(jìn)行煎煮,所得的藥液濃度為1 g/mL,采用紙片法和牛津杯法測(cè)定中藥對(duì)豬源大腸桿菌的體外抗菌活性,并對(duì)具抑菌作用的中藥采用宏量肉湯稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度。結(jié)果表明,黃芩平均最低抑菌濃度為208.33 mg/mL,金銀花、連翹則對(duì)3株試驗(yàn)菌均無(wú)抑制作用。孫啟慧[20]按照雙黃連口服液制備方法,分別制備雙黃連制劑復(fù)方、拆方以及各單味藥制劑共計(jì)70 批,分別進(jìn)行體外抑制金黃色葡萄球菌的藥效學(xué)研究,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出,復(fù)方雙黃連組,拆方金銀花+連翹組,黃芩+連翹組以及單味藥連翹組體外抑菌效果顯著,以上幾組藥物都含有連翹藥材,推測(cè)連翹中的一些成分對(duì)于金黃色葡萄球菌具有良好的體外抑制作用。

黃芩、金銀花和連翹除對(duì)普通大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有體外抑制作用外,對(duì)耐藥菌也同樣具有較好的抗菌效果。王永芬等[21]利用煎煮法,將黃芩、連翹、金銀花等14種中藥分別進(jìn)行處理,最終使藥液中生藥含量為1 g/mL,采用紙片擴(kuò)散法,以從河南省23個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)分離到的87株致病性耐藥大腸桿菌為試驗(yàn)菌株進(jìn)行試驗(yàn)后得到,含有抑菌活性成分、產(chǎn)生強(qiáng)抑菌效果(抑菌圈>15 mm)的中藥有石榴皮、黃芩、黃連,對(duì)各菌株抑菌率達(dá)到 60%以上的有黃芩、金銀花等。李藹文[22]選取了包括黃芩、金銀花、連翹在內(nèi)的16種中藥顆粒劑,制成濃度為1 g/mL的中藥顆粒劑溶液,采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法,探討這些中藥顆粒劑對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抗菌效果,并選取抑菌效果好的黃芩、連翹、薄荷3種顆粒劑,用連續(xù)稀釋法對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株的最低抑菌濃度進(jìn)行比較。同時(shí),選取連翹、蒲公英、黃芩、薄荷、苦參5種中藥水煎劑,通過(guò)K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法,比較顆粒劑與水煎劑抗菌效能的區(qū)別。最終結(jié)果顯示,連翹、黃芩對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌高度敏感,金銀花沒(méi)有抑菌作用;黃芩對(duì)耐藥大腸桿菌低度敏感,金銀花、連翹則無(wú)抑菌作用;同等濃度的顆粒劑抑菌效果明顯優(yōu)于水煎劑。潘杰等[23]選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等6種耐藥菌作為實(shí)驗(yàn)菌種,測(cè)定黃芩、金銀花等12味中藥顆粒的最低抑菌濃度及逆轉(zhuǎn)耐藥的最佳培養(yǎng)濃度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,黃芩對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為0.008 g/mL和0.016 g /mL,逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)菌的最佳培養(yǎng)濃度均為0.004 g/mL,金銀花的最低抑菌濃度分別為0. 025 g/mL和0. 031 g/mL,逆轉(zhuǎn)耐藥的最佳培養(yǎng)濃度為0. 003 g/mL和0. 008 g/mL。

盡管不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一種中藥的體外抑菌作用的研究結(jié)果存在差異,但初步可以判斷,雙黃連制劑在抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)作用過(guò)程中,組方配伍的3味藥中,連翹發(fā)揮了主要的藥效作用,而黃芩對(duì)大腸桿菌的抑制作用明顯優(yōu)于金銀花和連翹。

3 影響藥物體外抗菌活性的因素

3.1 中藥活性成分 中藥所含的活性成分與藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、采摘季節(jié)、用藥部位、藥材品種等有關(guān)。這提示我們,為保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,除了從正規(guī)途徑購(gòu)買藥材外,還應(yīng)在開(kāi)展體外抗菌活性試驗(yàn)前,按照藥典或相應(yīng)的中藥配方顆粒工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物質(zhì)量進(jìn)行把控,以盡可能減少藥物本身對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

3.2 中藥活性成分提取方法 中草藥成分復(fù)雜,同一種藥材不同提取方法所得提取物顯示出的有效成分及含量常存在差異。林麗超等[24]采用水提法和醇提法提取大黃、山楂、苦參、薄荷、黃芩和黃柏6種中草藥活性成分。除大黃、黃芩和薄荷的水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果比醇提物好外,其余的中草藥醇提物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌體外抑菌效果都比水提物好。這與王雅如[19]、王悅尚[25]報(bào)道的相同中藥采用不同的提取方法提取出的有效成分存在很大差異的結(jié)果一致。因此,研究中應(yīng)根據(jù)不同中藥有效成分采用不同的提取方法,以最大限度地發(fā)揮中藥的抑菌活性。

3.3 制劑工藝的影響 用中藥飲片煎煮藥湯本質(zhì)上是一個(gè)制劑過(guò)程,其藥效受藥材的浸泡、先煎后下、水量、火候、煎煮時(shí)間、煎煮容器等因素影響,操作相對(duì)復(fù)雜,同時(shí)還存在攜帶、使用不便、易于變質(zhì)的缺點(diǎn),不能更深層次地滿足現(xiàn)代臨床的需要。單味中藥濃縮顆粒是采用符合炮制規(guī)范的中藥飲片為原料,經(jīng)現(xiàn)代化科學(xué)提取、低溫濃縮、噴霧干燥、干壓制劑制成的現(xiàn)代“飲片”顆粒,相比于水煎劑具有工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控,不需煎煮,成分完全的特點(diǎn),有非常廣闊的發(fā)展前景。目前,已有研究者將顆粒劑與傳統(tǒng)水煎劑對(duì)耐藥菌株的體外抑菌作用進(jìn)行比較[22,26,27],可以看出顆粒劑對(duì)細(xì)菌的抑制作用不劣于水煎劑,但還需要更多研究進(jìn)一步驗(yàn)證中藥配方顆粒是否保持了傳統(tǒng)煎劑的藥效以及具體的抑菌效果。

4 小 結(jié)

中藥抗菌有著悠久的歷史,許多研究已表明中藥對(duì)耐藥細(xì)菌有抑菌作用,這對(duì)抗感染中藥的開(kāi)發(fā)、研究和應(yīng)用起了重要作用,同時(shí)也開(kāi)創(chuàng)了中藥研究的新領(lǐng)域。

通過(guò)對(duì)黃芩、金銀花、連翹3種中藥對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌體外抑菌效果研究進(jìn)展進(jìn)行綜述可以看出,雙黃連制劑確有抗菌作用[20],對(duì)于金黃色葡萄球菌,主要是制劑中的連翹發(fā)揮體外抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥效作用,黃芩對(duì)大腸桿菌的抑制作用則明顯優(yōu)于金銀花和連翹。但目前的研究更多地集中于單味藥材抗菌活性的探索,缺乏與復(fù)方制劑療效的具體比較或圍繞方劑整體建立相關(guān)的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系,尤其在獸醫(yī)臨床中基本不會(huì)使用單味藥物進(jìn)行治療。馮年平等[28]也發(fā)現(xiàn),中藥不同的配伍方式與其藥效成分的體內(nèi)代謝特征之間存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,中藥方劑的作用機(jī)制與其配伍原理是密不可分的。因此,僅從個(gè)別中藥的體內(nèi)外藥效研究詮釋作用機(jī)制、評(píng)價(jià)抗菌效果是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。從中醫(yī)經(jīng)方理論看,雙黃連方劑中的三味中藥的組方是共同發(fā)揮作用的,一種觀點(diǎn)認(rèn)為連翹為君藥,作用辛涼透表,清熱解毒,同時(shí)又具芳香避穢的功效,金銀花、黃芩辛涼,為臣藥,助君藥解表透熱。另一種解釋認(rèn)為方中金銀花為君藥;黃芩性味甘寒,芳香疏散,善解肺經(jīng)熱邪,又可清解心胃之熱毒,為君藥亦為臣藥;連翹與黃芩共為臣藥[20]。因此如何發(fā)揮雙黃連方劑的綜合作用或與抗菌藥物聯(lián)用以提高治療效果又可減少藥物用量等問(wèn)題,還需要開(kāi)展試驗(yàn)繼續(xù)深入研究。同時(shí),我們還看到中藥抗菌效果的前期研究主要以水煎劑居多,而配方顆粒是在傳統(tǒng)中藥飲片基礎(chǔ)上發(fā)展的創(chuàng)新產(chǎn)物,相比于水煎劑具有成分完全、療效確切的特點(diǎn),有明顯的發(fā)展優(yōu)勢(shì),在畜禽疫病防控應(yīng)用方面可進(jìn)一步挖掘。