復(fù)方中藥治療雞實驗性鎘中毒的效果研究

徐 浩,艾 淼,楊 劍,2,宋旭琴,2,歐德淵,2

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025;2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室,貴陽 550025)

鎘(Cadmium,Cd)是一種有色重金屬元素,隨著工業(yè)化的發(fā)展和人類活動導(dǎo)致環(huán)境鎘污染越來越嚴重[1]。鎘及其相關(guān)化合物可通過環(huán)境中的水、空氣和土壤進入植物體內(nèi),并通過食物鏈在動物及人體內(nèi)蓄積,誘導(dǎo)細胞氧化損傷和細胞凋亡,造成組織器官受損[2]。20世紀50年代,日本富山縣神通川流域居民由于食用“鎘米”而引發(fā)“痛痛病”事件[3]。也有研究表明大氣鎘污染主要通過呼吸道進入人體,當(dāng)鎘進入人體后,它通過紅細胞和白蛋白進入血液,然后積聚在腎臟、肝臟和腸道[4]。鎘的生物半衰期長達10-30年,進入機體后可持續(xù)發(fā)揮毒性,損害身體健康[5]。目前普遍采用西藥緩解鎘對組織器官的損傷作用,降低鎘在體內(nèi)的蓄積,但存在不同程度的不良反應(yīng)[6]。近年研究發(fā)現(xiàn):中藥對鎘中毒所致的肝腎損傷、耳損傷有一定保護作用[7-9]。中藥治療鎘中毒與西藥不同,中藥通過多途徑多靶點治療鎘中毒,更強調(diào)整體性,中藥既可通過減少鎘吸收加速鎘代謝,又可通過抗氧化損傷、增強機體防御力等途徑協(xié)同治療鎘中毒[10,11]。故本研究以染鎘的黑腳麻雞為試驗動物,用復(fù)方中藥進行治療,通過體質(zhì)量、病理學(xué)觀察、組織器官鎘含量及抗氧化功能等測定,對復(fù)方中藥對鎘致雞內(nèi)臟及骨骼損傷的保護作用進行研究,為復(fù)方中藥防治禽類鎘中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 根據(jù)加味腎氣湯[12]基礎(chǔ)上稍加改進的復(fù)方中藥,主要成分為黃芪、當(dāng)歸、熟地、山萸肉、云茯苓、澤瀉、丹皮、肉桂、熟附子、淮山藥10味中藥,均購自貴州省貴陽市花溪區(qū)中醫(yī)院,執(zhí)行標(biāo)準為《中國藥典》2015年版一部[13]。置于80 ℃烘箱烘干,粉碎過100目篩保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 氯化鎘(CdCl2·2.5H2O,分析純,上?；瘜W(xué)試劑廠),丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒,均購自上海盈公酶聯(lián)檢測試劑有限公司。

1.3 主要儀器 ICP-MS-X2電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,美國Thermo Fisher公司;Sunrise-Basic Tecan酶標(biāo)儀,帝肯奧地利有限公司。

1.4 復(fù)方中藥治療劑量的確定 本試驗以高劑量4.7 g/kg復(fù)方中藥、中劑量2.35 g/kg復(fù)方中藥、低劑量0.47 g/kg復(fù)方中藥飼喂染鎘黑腳麻雞,高劑量中藥組體重顯著高于染鎘組(P<0.05),中劑量與低劑量中藥組也高于染鎘組,但差異不顯著。故本試驗劑量為4.7 g/kg為此次試驗治療的劑量。

1.5 分組與處理 將90只30日齡體重相近黑腳麻雞(購于貴陽市龍洞堡某禽苗批發(fā)公司)隨機分為3組,30只/組,公母各半,分別為空白對照組、陽性組、中藥組,空白組飼喂基礎(chǔ)日糧,陽性組飼喂基礎(chǔ)日糧+40.31 mg/kg CdCl2,中藥組飼喂基礎(chǔ)日糧+40.31 mg/kg CdCl2+4.7 g/kg復(fù)方中藥。各組均分籠常規(guī)飼養(yǎng),溫度控制在20 ℃左右,濕度70%左右,自由采食和飲水。飼料組分:粗蛋白質(zhì)≥16.0%,粗纖維≤8.0%,粗灰分≤8.0%,鈣為 0.6%～1.3%,總磷≥0.5%,鹽0.2%～0.8%,蛋氨酸≥0.65%,水分≤13.5%。電感耦合等離子體質(zhì)譜法測得配合飼料內(nèi)鎘含量≤0.201 mg/kg,符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(GB13078-2001:雞配合飼料內(nèi)鎘含量≤0.5 mg/kg)。第30 d、60 d、90 d時每組隨機取10只雞,測定體重,采血后處死,采集組織器官。將采集的動物樣品先用濾紙吸干水,然后用高速組織搗碎機搗碎后,各樣稱取約 0.5 g 于消解罐中,再各加入 10 mLHNO3,同時做空白樣,擰松蓋子置于通風(fēng)櫥內(nèi)預(yù)消解 2 h,再擰緊蓋子搖勻,放入微波消解儀中消解。消解結(jié)束后,待完全冷卻至室溫,將消解液用超純水轉(zhuǎn)移并定容至 50 mL容量瓶中,混勻待檢[14]。

1.6 病變觀察 常規(guī)石碏切片,HE染色后進行病變觀察。

1.7 氧化還原指標(biāo)檢測 血清中SOD、GSH-Px、NOS、MDA和NO的采用試劑盒測定,操作方法嚴格按說明書進行。

1.8 組織器官鎘含量測定 心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、跖骨中鎘含量檢測均參照張曦[15]文獻中ICP-MS法進行。按式計算樣品中鎘的含量:Xi=(Ci-Cio)×V/m×100,Xi為樣品中鎘的含量/(mg/kg);Ci為從標(biāo)準曲線上查得樣液中鎘的濃度/(μg/L);Cio為從標(biāo)準曲線上查得空白溶液中鎘的濃度/(μg/L);V為樣液的總體積/mL;m為樣品的質(zhì)量/g。

1.9 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2010處理后,采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準差”表示,結(jié)果的差異性分析采用配對樣本t檢驗法,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥對染鎘雞體重的影響 由表1可知,飼養(yǎng)30 d、60 d和90 d后,陽性組雞體重均顯著低于空白對照組的雞體重(P<0.05);中藥治療組體重顯著高于陽性組雞體重(P<0.05)。

表1 復(fù)方中藥對染鎘雞體重的影響 (kg)Tab 1 The Effect of Compound Chinese Medicine on the Body Weight of Cadmium Exposed Chickens (kg)

2.2 復(fù)方中藥對染鎘雞組織器官病變的影響 陽性組心肌纖維間質(zhì)內(nèi)有大量的嗜中性粒細胞和淋巴細胞等炎癥細胞浸潤,纖維出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象,部分出現(xiàn)斷裂,并伴有壞死灶(圖1-a2);中藥治療組炎癥細胞明顯減少,心肌纖維斷裂現(xiàn)象減少,排列較為整齊,壞死細胞減少(圖1-a3)。

A1.空白組心臟;A2.陽性組心臟;A3.中藥治療組心臟;B1.空白組肝臟;B2.陽性組肝臟;B3.中藥治療組肝臟;C1.空白組肺臟;C2.陽性組肺臟;C3.中藥治療組肺臟;D1.空白組腎臟;D2.陽性組腎臟,D3.中藥治療組腎臟;E1.空白組脾臟;E2.陽性組脾臟;E3.中藥治療組脾臟;F1.空白組跖骨;F2.陽性組跖骨;F3.中藥治療組跖骨圖1 復(fù)方中藥對染鎘雞心臟、肝臟、肺臟、脾臟、跖骨組織結(jié)構(gòu)的影響(400×)Fig 1 Effect of Compound Chinese Medicine on the Structure of Heart, Liver, Lung, Spleen, and Metatarsal Bone in Cadmium Exposed Chickens(400×)

陽性組肝臟中央靜脈有出血、充血現(xiàn)象,周圍有以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤,肝細胞索排列紊亂,肝小葉界限不清(圖1-b2);中藥治療組肝細胞索結(jié)構(gòu)變清晰、炎性細胞浸潤減少、中央靜脈充血現(xiàn)象明顯緩解(圖1-b3)。

陽性組肺泡內(nèi)充滿大量的中性粒細胞,肺間質(zhì)炎癥細胞浸潤,肺泡壁毛細血管擴張淤血,部分肺泡斷裂,部分細胞脫落、壞死(圖1-c2)。中藥治療組肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)的炎癥細胞明顯減少,出血充血現(xiàn)象緩解(圖1-c3)。

陽性組腎小球旁的間質(zhì)內(nèi)有以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤,部分腎小管結(jié)構(gòu)破壞,近曲小管、遠曲小管上皮細胞腫脹,管腔滲出物增多,腎間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)出血、充血現(xiàn)象(圖1-d2);中藥治療組腎小管受損結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù),腎小球腫脹現(xiàn)象減輕(圖1-d3)。

陽性組脾臟出現(xiàn)出血性壞死并伴有炎癥細胞浸潤(圖1-e2);中藥治療組脾臟出血現(xiàn)象減輕,炎癥細胞大量減少(圖1-e3)。

陽性組中骨小梁纖細且有部分斷裂,骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量明顯減少,部分骨髓腔增大甚至破裂(圖1-f2);中藥治療組骨小梁排列較為整齊,骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量增多(圖1-f3)。

2.3 復(fù)方中藥對陽性組雞組織器官中鎘含量的影響 30 d,中藥治療組肝臟、腎臟、跖骨的鎘含量顯著低于陽性組的含量(P<0.05);60 d,中藥組心臟、肝臟、肺臟、腎臟、腿骨的鎘含量均是顯著低于陽性組的含量(P<0.05);90 d,中藥治療組心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、跖骨的鎘含量是顯著低于陽性組的含量(P<0.05)。見表2。

表2 復(fù)方中藥對染鎘雞組織器官中鎘含量的影響 (mg/kg)Tab 2 Effect of Compound Chinese Medicine on Cadmium Content in Tissues and Organs of Cadmium Exposed Chickens

2.4 復(fù)方中藥對染鎘雞血清抗氧化指標(biāo)的影響 由表3可知,對試驗雞進行染鎘飼養(yǎng)30 d、60 d和90 d,空白對照組血清中GSH-Px、NOS、SOD的活性NO的含量都是顯著高于陽性組的值(P<0.05),血清中MDA的含量顯著低于陽性組的含量(P<0.05);在染鎘飼養(yǎng)30 d后中藥治療組血清中的GSH-Px、NOS、SOD活性NO的含量都是顯著高于陽性組的值(P<0.05),MDA的含量是顯著低于陽性組的含量(P<0.05);在染鎘飼養(yǎng)60天后,中藥治療組血清中NOS、SOD、GSH-Px的活性NO的含量都是顯著高于陽性組的值(P<0.05),MDA的含量為顯著低于陽性組的含量(P<0.05);在染鎘飼養(yǎng)90天后,GSH-Px、NOS、SOD活性NO含量都是顯著高于陽性組的值(P<0.05),MDA的含量都是顯著低于陽性組的含量(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

鎘可致家禽體重增重減緩甚至負增長,降低飼料轉(zhuǎn)化率[16]。本試驗中鎘暴露后陽性組雞體重下降,中藥治療組體重顯著高于陽性組,隨著治療時間的延長,中藥治療組的體重逐漸趨近空白對照組的體重。這與吳海濤[17]等用加味腎氣湯治療大鼠慢性鎘中毒結(jié)果一致,中藥治療組體重增長率優(yōu)于染鎘組。說明本試驗選用的復(fù)方中藥有利于染鎘雞體重的增長,能提高其生長性能,對染鎘雞體重下降起到很好的緩解作用。

通過檢測各組織器官之間的鎘含量,發(fā)現(xiàn)中藥治療組各組織鎘含量顯著低于陽性組,且其差距隨著治療時間延長而增加,顯示出該復(fù)方中藥緩解鎘中毒的時間-效應(yīng),飼喂90 d后,中藥治療組肝臟、腎臟的炎癥細胞明顯減少,出血現(xiàn)象明顯減輕;脾臟的萎縮現(xiàn)象得到緩解;心臟、肺臟、跖骨斷裂受損的結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)。相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠拮抗鉛鎘引起的脾細胞凋亡,降低鉛鎘致雞脾臟細胞DNA片段化程度,減輕重金屬對細胞DNA的損傷[18],綠原酸可與體內(nèi)的二價重金屬鎘離子進行螯合,降低血鎘水平,拮抗鎘中毒引起的氧化應(yīng)激損傷,對雞鎘中毒引起肝細胞損傷起保護作用[19]。本試驗復(fù)方中藥治療后各組織器官鎘含量都顯著低于陽性組,且治療天數(shù)與鎘蓄積量呈負相關(guān),可能是該復(fù)方中藥通過促進鎘排出來緩解鎘對其各組織器官的損傷。

研究表明,鎘暴露會導(dǎo)致機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激,鎘既可以促進機體產(chǎn)生氧化損傷,又可以使機體的抗氧化功能受到損害[20],染鎘動物肝細胞中GSH-Px和SOD活力下降,而MDA水平升高,肝臟對氧化自由基的消除能力明顯下降[21],機體NO濃度升高與活性氧反應(yīng)生成更高氧化能力的亞硝基自由基,一氧化氮合酶NOS活性增強,產(chǎn)生更多NO而造成氧化損傷[22]。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物如姜黃素、槲皮素可抑制NOS的活性降低NO濃度而起到抗氧化作用[23]。山藥多糖對鎘染毒大鼠的肝臟及腎臟氧化損傷具有明顯的拮抗作用[24],可提高SOD和GSH-Px的含量,降低MDA的含量,加速鎘在肝臟代謝產(chǎn)生自由基的清除[25]。當(dāng)歸多糖改善鎘致肝損傷機制則可能與調(diào)節(jié)參與物質(zhì)代謝相關(guān)的酶活性和調(diào)控參與細胞凋亡的相關(guān)凋亡蛋白的表達緊密相關(guān)[26]。染鎘后機體細胞在鎘的刺激下可降低SOD的活性同時又產(chǎn)生大量的自由基,引起鎘中毒體內(nèi)自由基量越來越多,而黃芪能抵抗生物膜質(zhì)過氧化,清除氧自由基,保護染鎘的睪丸組織[27]。在本試驗中,中藥治療組血清中GSH-Px、NOS、NO和SOD的含量均顯著高于陽性組,但MDA的含量顯著低于陽性組, 說明該復(fù)方中藥能夠有效升高陽性組雞血清中的GSH-PX、NOS、NO和SOD的值,并且對于血清中MDA的含量的降低具有一定促進作用,可能與該復(fù)方中藥中黃芪、當(dāng)歸、山藥能夠有效升高陽性組雞血清中抗氧化酶活力,減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物有關(guān)。

本試驗復(fù)方中黃芪、當(dāng)歸、熟地、山萸肉、云茯苓、淮山藥為該復(fù)方中藥的重要組成成分,具有較強的抗氧化和提高機體免疫力功能,可通過降低鎘在組織中的蓄積,清除體內(nèi)自由基,調(diào)節(jié)參與物質(zhì)代謝相關(guān)的酶活性來緩解染鎘雞組織器官的損傷,可為復(fù)方中藥應(yīng)用于治療畜禽鎘中毒提供一定的參考依據(jù)。