超高效液相色譜-串聯質譜法測定豬尿中7種α2-受體激動劑殘留

龔 波,王 峻,董文婷,陳向丹,李菁菁,金秀娥,周 平

(湖北省獸藥監察所,武漢 430070)

以可樂定為代表的α2-受體激動劑在現代醫學中常用于高血壓的治療,在獸醫上廣泛用于鎮靜和鎮痛,也能加強麻醉藥的作用和減少用量[1]。科學研究發現,該類藥物可以通過作用于α2-受體,促進機體釋放生長激素釋放因子,調節磷酸腺苷水平,從而引起生長激素分泌增加[2-4]。從王雷杰[5]的動物實驗中可以看出,飼喂添加可樂定的飼料能顯著提高豬的瘦肉率,降低脂肪比率和背膘厚,改善豬的胴體組成。近年來,“瘦肉精”事件仍屢禁不止,時有發生,而且非法添加品種和手段不斷升級,從鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等β-受體激動劑到可樂定等這類α2-受體激動劑。2010 年12 月27 日農業部1519 號公告已明確把可樂定列為《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》清單。因此,制定和完善α2-受體激動劑類藥物多殘留檢測方法迫在眉睫。經查閱文獻發現,對α2-受體激動劑類藥物殘留檢測的研究主要集中于豬組織[6]、飼料[7]、血漿[8-9]、豬肉[10-11]、豬肝[12]、動物源食品[13-14]等基質中的可樂定等數種α2-受體激動劑含量檢測。2004年,M.-H. Spyridak[15]報道了氣相質譜法檢測馬尿中的賽拉嗪的方法;國家標準GB 31660.7-2019《豬組織和尿液中賽庚啶及可樂定殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》以及孫曉亮[16]對豬尿中可樂定的殘留檢測進行了規定及研究。目前還未見以豬尿為基質,同時測定多種α2-受體激動劑藥物的方法。本研究在不傷害豬本體的前提下取尿液樣本,可快速、準確的同時測定7種α2-受體激動劑藥物,填補檢測方法空白,為實驗室檢測提供有效技術支撐。

1 材料和方法

1.1 儀器與耗材 超高效液相色譜-串聯質譜儀Aglient 6470,配電噴霧離子源(ESI); MS3型渦旋混合器(德國IKA公司);pH計(上海雷磁公司,PHS-3E);冷凍高速離心機,轉速≥10000 r/min(日立,CR21 N型);氮吹儀(美國Organomation公司,N-EVAP型);固相萃取裝置(美國Agilent公司);MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國water公司);微孔濾頭(0.22 μm有機相,美國Agilent公司)。

1.2 藥品與試劑 賽拉嗪、鹽酸可樂定、鹽酸替扎尼定、溴莫尼定、胍法辛、胍那芐、鹽酸安普樂定含量均≥90.0%,除胍法辛、胍那芐購于First Standard外,其余對照品均購于CATO公司;甲醇、乙腈(色譜純,Tedi公司);甲酸(色譜純,J.T.Baker,88%); 氫氧化鈉、乙酸乙酯、氯化鈉、氨水均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);實驗室用水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的前處理 取試樣5.00 mL,于50 mL塑料離心管中, 用5 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至10.0～11.0,渦旋混勻,加乙酸乙酯10 mL,加1.5～2.0 g氯化鈉,充分振蕩,于10000 r/min離心5 min,轉移上清液于另一50 mL塑料離心管中。下層溶液中加乙酸乙酯10 mL重復提取一次,合并兩次上清液,50 ℃氮氣吹干,加0.1 %甲酸:甲醇溶液(90∶10)5.0 mL溶解殘余物,備用。

取MCX固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL活化,把全部備用液以每秒一滴的速度過柱,依次用水3 mL、甲醇3 mL分別淋洗,真空抽干,5 %氨水甲醇溶液5 mL洗脫,收集洗脫液,于50 ℃水浴中氮氣吹干。用0.1%甲酸:甲醇溶液(90∶10)1.0 mL溶解殘余物,渦旋1 min,過0.22 μm微孔濾頭,供液相色譜-串聯質譜測定。

1.3.2 液相色譜條件 色譜柱:C18柱,粒徑2.7 μm,內徑2.1 mm,柱長100 mm,或相當者;柱溫35 ℃;流速0.3 mL/min;進樣量10 μL;梯度洗脫程序延遲時間:1 min。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

1.3.3 質譜參考條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;毛細管電壓(Capillary Voltage):4000 V;霧化溫度(Gas temp):325 ℃;霧化器流速(Gas flow):10 L/min;霧化器壓力(Nebulizer):40 psi;鞘氣溫度(Sheath gas temp):300 ℃;鞘氣流速(Sheath gas flow):11 L/min;監測模式:多反應監測(MRM采集模式)7種α2-受體激動劑的MRM參數見表2。

表2 7種α2-受體激動劑MRM參數Tab 2 MRM parameters of seven α2-agonists

1.3.4 標準溶液的配置 標準儲備液:分別精密稱取可樂定、溴莫尼定、替扎尼定、胍法辛、胍那芐、安普樂定、賽拉嗪7種對照品,用甲醇分別配制成1 mg /mL標準儲備液,于2～8 ℃ 以下溫度保存,有效期6個月。

混合標準中間液:分別準確量取1.00 mL可樂定、溴莫尼定、替扎尼定、胍法辛、胍那芐、安普樂定、賽拉嗪標準儲備液(1.3.1項)置于100 mL量瓶中,用甲醇配制成濃度為10 μg/mL的混合標準中間液,于2～8 ℃以下溫度保存,有效期1個月。

基質匹配標準曲線的構建:取空白樣品按1.3.1項處理后作為基質空白溶液。準確移取適量混合標準中間液,用基質空白溶液配制成1、5、10、20、50、80 ng/mL 基質匹配標準工作液,供超高效液相色譜-串聯質譜測定,現用現配。

1.4 基質效應測定 按照1.3.4項方法配制基質匹配標準曲線,同時準確移取適量的混合標準中間液,用0.1%甲酸:甲醇溶液(90∶10)配制成同樣濃度的溶劑標準曲線,分別上機測試。基質效應計算公式為:基質效應(ME)=(基質匹配標準曲線斜率/溶劑配制標準曲線斜率-1)×100%。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 用超高效液相色譜-串聯質譜測定基質匹配系列標準工作液,7種α2-受體激動劑在1～80 μg/L濃度范圍內均呈良好線性關系,線性方程及相關系數如表3所示。

表3 基質匹配標準曲線方程Tab 3 Matrix matching standard curve equation

2.2 準確度與精密度 為考察方法的準確度和精密度,進行了添加回收試驗。按照上述處理和測定方法,選取了豬尿液空白樣品,各添加3個不同濃度(即0.3、0.6、3 μg/L),每個水平設3個平行,重復試驗3批。求每個樣品的回收率和批內,批間相對標準偏差。其中豬尿空白樣品添加回收試驗測定結果見表4。該實驗表明,動物尿液中7種α2-受體激動劑平均回收率為60%～110%,精密度小于15%,說明該方法具有較好的準確度和精密度。圖1、圖2為空白豬尿及添加回收率質譜圖。

圖1 空白豬尿樣品的特征離子質譜圖Fig 1.Characteristic ion mass chromatogram of blank pig urine

圖2 豬尿中七種α2-受體激動劑添加回收試驗的特征離子質譜圖(3 μg/L)(圖中依次為安普樂定、胍法辛、胍那芐、可樂定、賽拉嗪、替扎尼定、溴莫尼定)Fig 2.Characteristic ion mass chromatogram of seven α2-agonists added in blank pig urine(3 μg/L)(The order in the diagram is Apraclonidine、Guanfacine、Guanabenz、Clonidine、Xylazine、Tizanidine、Brimonidine)

2.3 檢測限和定量限 豬尿液中7種α2-受體激動劑檢測限為0.1 μg /L,信噪比S/N(Peak to Peak)>3;方法定量限為0.3 μg /L,信噪比S/N(Peak to Peak)>10。

2.4 基質效應的研究 對基質效應進行了研究,結果見表5。一般認為|ME|<20% 為弱基質效應, 20%≤|ME|≤50%為中等程度基質效應,|ME|>50%強基質效應。結果表明,部分待測物存在中等程度基質抑制效應,為降低基質效應對定量結果所的影響,采用基質匹配標準曲線外標法進行定量分析。

表5 7種α2-受體激動劑的基質效應Tab 5 ME of seven α2-agonists

2.5 緩沖液pH值的研究 本實驗選擇在堿性條件下進行樣品提取,分別用5 M氫氧化鈉溶液調節樣品pH至8.0,9.0,10.0,11.0,11.5,12來進行比較,結果見表6。

表6 不同pH值對添加回收率的影響Tab 6 The influence of different pH value on the recovery rate

由表6可以看出,當樣品pH為8.0時,安普樂定、溴莫尼定峰形雜亂,無法定性、定量;當pH為9.0時,多種待測物添加回收效果不理想;當pH為11.5、12時,胍那芐出現不同程度的基質增強作用,導致添加回收率超過120%;而當pH范圍為10.0、11.0時,樣品峰形、回收率等都能達到理想效果。

3 討論與結論

3.1 色譜條件的確定 色譜柱的選擇:考察了常見的色譜柱ZORBAX SB-C18和Poroshell120 SB-C18對色譜峰進行分離,比較分離度、響應值以及峰形。通過比較發現,利用ZORBAX SB-C18可以獲得較好的分離度,但是部分目標物會產生拖尾的色譜峰。Poroshell120 SB-C18均可以使7種待測物在5分鐘內快速出峰,由于該色譜柱的填料孔徑為2.7 μm,所以峰形也會比較窄,不會產生拖尾峰或者寬峰。考慮到方法的廣泛適用性,最終推薦C18柱 (2.1×100 mm,2.7 μm),或相當者。

流動相的選擇:α2-受體激動劑具有一定堿性特征,在酸性流動相體系中易產生穩定的[M+H]+離子,因此考慮常用的0.1%甲酸水作為流動相水相。為了避免溶劑效應,流動相有機相初始比例和樣品復溶液有機相比例保持一致,選用0.1%甲酸水-甲醇的流動相體系,同時采用流動相梯度變化保證目標物有效分離。

3.2 質譜條件的優化 七種α2-受體激動劑均含有胺類結構,且極性較強,實驗中選擇正離子(ESI+)模式。配制100 ng/mL的標準溶液,采用不經過色譜柱直接連接質譜的方式,在全掃描中找出每個化合物的母離子,利用MRM采集模式優化子離子、碰撞電壓、碰撞能量等參數。

3.3 樣品前處理方法的優化

3.3.1 緩沖液pH值的優化 由于α2-受體激動劑具有一定堿的特性,在水環境中存在一定的電離現象,從而導致了有機試劑提取不完全。為了有效抑制其離子化的現象,本實驗的緩沖液適合選擇堿性環境。隨機選取20份豬尿液樣品,測得其pH范圍為5.6～8.1,若直接加入一定量的堿性溶液[10-13],并不能保證樣品提取溶液pH的穩定性,故本實驗采用5 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至10.0～11.0的方式保持提取的堿性環境。

3.3.2 提取試劑的選擇 對樣品中α2-受體激動劑的提取液進行了摸索,采用了常用的乙酸乙酯、乙腈提取溶劑。通過比較,乙腈提取效率不如乙酸乙酯提取,并且當用乙腈提取時,胍法辛基質干擾明顯,故選用乙酸乙酯作為提取試劑。

3.3.3 樣品凈化過程優化 α2-受體激動劑屬于堿性藥物,故考慮對堿性藥物具有高選擇性的混合型陽離子小柱進行固相萃取凈化。因樣品經乙酸乙酯提取、氮氣吹干復溶、高速離心后即可得到較為清亮的液體,我們選擇了3種方法進行比較,一為樣品經提取操作后不經過小柱凈化直接離心取上清液上機,二為參考李艷明[11]李丹妮[6]分別采用PRIME HLB、QuEChERS凈化后上機,三為樣品經提取后用混合型陽離子小柱凈化后上機。實驗顯示,方法二樣品經凈化后采集到的質譜圖與方法三相當,但部分上機液體呈現淡黃色,不如方法三凈化后透亮澄清,且PRIME HLB、QuEChERS成品價格較高,若采用填料自己填充又比較麻煩延長實驗操作時間。而方法一采集到質譜圖雜質干擾較大,長期操作會對液質聯用儀造成污染及損害。從凈化效果、經濟實用等多方面考慮,此步驟選擇用常用的混合型陽離子小柱凈化。

3.3.4 樣品復溶液的選擇 考慮復溶液與流動相的一致性,分別比較了乙腈:0.1%甲酸水溶液=20∶80,甲醇∶0.1%甲酸水溶液=20∶80,乙腈∶0.1%甲酸水溶液=10∶90,甲醇∶0.1%甲酸水溶液=10∶90,甲醇∶0.1%甲酸水溶液=5∶95等5種溶劑作為最終進樣前的樣品復溶液。發現當復溶液為乙腈∶0.1%甲酸水溶液=20∶80時,安普樂定和溴莫尼定峰型較差,不符合定性定量要求,同時當有機相為乙腈時,液質響應普遍沒有甲醇作為有機相時高。而當有機相為甲醇時,過高的甲醇濃度反而會抑制待測物的響應。當甲醇比例為5%、10%時,均能得到較為滿意的液質圖譜,因甲醇比例為10%時的待測物響應略高于5%甲醇,故最終確定樣品復溶液為甲醇∶0.1%甲酸水溶液=10∶90。

本研究建立了一種適用于豬尿液中α2-受體激動劑類藥物的超高效液相色譜串聯質譜的檢測技術。該方法在堿性環境中用乙酸乙酯提取,混合型陽離子柱凈化,結合基質匹配標準曲線定量,無需采用內標校正[9],具有提取效率高,靈敏度高,檢測成本低的特點,滿足了檢測要求,彌補了暫無豬尿中多種α2-受體激動劑類藥物檢測方法的行業空白。