動物源性食品中酰胺醇類獸藥殘留檢測的樣品前處理技術研究進展

汪海珍,許紅霞,李 朔,潘源虎,陳冬梅

(華中農業大學動物醫學院,國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU),武漢 430070)

酰胺醇類藥物(Chloramphenicols,CAPs)是一類高效廣譜抗生素藥物,包括:氯霉素(Chloramphenicol,CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)、氟苯尼考(Florfenicol,FF)、氟苯尼考胺(Florfenicol amine,FFa)、琥珀氯霉素、棕櫚氯霉素等。酰胺醇家族中最古老的成員是CAP,因其抗菌效果好,價格低廉,被廣泛用于動物細菌疾病的預防,但CAP存在嚴重的毒副作用。美國、歐盟以及包括中國在內的許多國家和地區均規定動物性食品中不得檢出CAP。因此,TAP和FF被相繼開發出來作為CAP的替代品,主要用于治療牛、豬和家禽的呼吸道和消化道傳染病。近年來,該類藥物的大量以及不合理使用,造成在動物性食品中的一定程度的殘留,對人體健康造成了嚴重威脅。因此,為了預防和控制動物性食品中的污染,加強對酰胺醇類藥物檢測方法的研究具有重要意義。樣品前處理技術是動物性食品中獸藥殘留分析的關鍵環節,直接影響檢測的效率和準確度。本文對近幾年應用于動物性食品中酰胺醇類獸藥殘留的樣品前處理技術進行綜述,以期為動物性食品中酰胺醇類獸藥殘留檢測提供依據。

1 常見的樣品前處理技術

1.1 液液萃取(Liquid-liquid extraction,LLE) LLE利用同一物質在兩種不相溶的溶劑中溶解度不同,從而達到分離、提取或純化的目的。在動物源性食品的CAPs檢測分析中,乙酸乙酯和乙腈是應用最多的提取溶劑。通常單獨或者作為混合物用于酰胺醇類藥物提取[1-2]。但液液萃取方法存在萃取劑使用量較大、同時易產生乳化現象等問題,因此出現了新型的液相萃取技術。

離子液體-鹽水雙相體系通常是由一種有機鹽(親水性離子液體)、一種無機鹽(如磷酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物等)和水相組成,它綜合了離子液體和雙水相體系的優點。Yao等[3]報道了用聚氧乙烯十二烷基醚-鹽水雙相萃取系統提取雞蛋、牛奶和蜂蜜中的TAP,該方法的回收率可達99.59%。Sichilongo等[4]用THF-水溶液提取牛肌肉組織中CAP、TAP和FF,THF-水溶液具有比乙腈-水溶液和甲醇-水溶液更高的提取效率。

1.2 分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME) DLLME是基于樣品溶液、萃取劑(與水互不相溶)和分散劑(與水相和萃取劑混溶)組成的三重溶液系統開發的一種新型液相微萃取技術。與LLE相比,其基本原理相似,但實現了液液萃取的微型化,減少了有機溶劑的使用。DLLME方法具有操作簡便、快速、富集效率高、萃取劑使用量少、環境友好型等優點。

DLLME與其他提取凈化方法結合,用于提取樣品中的CAP,能夠提高萃取效率。Campone等[5]采用超聲輔助DLLME提取蜂蜜中的CAP,超高效液相色譜-串聯質譜(Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)測定。三氯甲烷為萃取劑,乙腈為分散劑,用10%NaCl提高離子強度。該方法的回收率為54%～60%,相對標準偏差(Relative standard deviation,RSD)小于5%,檢測限(Limit of detection,CCα)和定量限(Limit of quantification,CCβ)分別為0.0115 μg/kg和0.0364 μg/kg。Amelin等[6]結合DLLME和QuEChERS方法同時提取凈化食品中CAP和TAP。樣品用乙腈-甲酸提取,加入無水MgSO4和NaCl等無機鹽,離心后移取上清液,用PSA和C18凈化,二氯甲烷為萃取劑進行DLLME萃取。方法回收率為64%～87%,RSD小于9%。

1.3 加速溶劑萃取(Accelerated solvent extraction,ASE) 加速溶劑萃取方法是采用常規溶劑,在較高溫度下用溶劑對固體或半固體樣品進行萃取的樣品前處理技術。ASE的基本原理是利用升高溫度和壓力,增加物質溶解度和溶質擴散速度,提高萃取效率。與傳統的提取方式相比,ASE具有萃取快速、萃取溶劑用量少、樣品回收率高,提取過程自動化等特點。Wu等[7]建立了ASE萃取結合液相色譜-質譜聯用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)檢測家禽羽毛中TAP、CAP、FF殘留分析方法。該方法的回收率60.4%～107.6%之間。檢測限(Limit of detection,LOD)為0.2～3.0 μg/kg,定量限(Limit of quantification,LOQ)為0.5～8.3 μg/kg。王波等[8-9]采用ASE方法萃取鵪鶉蛋和鴿蛋中CAP、TAP、FF以及FFa。該實驗將樣品置于硅藻土研磨后,裝入萃取池,萃取溶劑為甲醇:氨水:水溶液(97∶2∶1,V/V/V),萃取溫度為80 ℃,壓力為1.034×104kPa,靜態萃取時間5 min。方法LOD為0.04～0.5 μg/kg,LOQ為0.08～1.5 μg/kg,平均回收率為90.26%～105.73%,RSD均低于3.29%。Wang等[10]用ASE法提取禽蛋中TAP、FF和FFa,用乙腈-氨水(98∶2,V/V)萃取樣品,用乙腈飽和正己烷脫脂。LOD和LOQ分別為1.8～4.9 μg/kg和4.3～11.7 μg/kg,回收率均在80.1%以上。

1.4 亞臨界水萃取(Subcritical water extraction,SWE) 亞臨界水萃取是一種環保的萃取技術,也稱為加壓熱水萃取(Pressurized hot water extraction,PHWE)。SWE是一種從固體和半固體樣品中定量萃取極性和非極性化學物質的方法。SWE基于在100 ℃和374 ℃(水的臨界點,374 ℃和22 MPa)之間的溫度下使用水作為萃取溶劑,并且在足夠高的壓力下使其保持液態。

Xiao等[11]利用亞臨界水萃取家禽組織中的CAP、TAP、FF和FFa。將樣品加入硅藻土混合研磨后,裝入不銹鋼萃取池中。萃取流程如下:0.2%氫氧化銨水溶液作為萃取溶劑,萃取溫度為150 ℃,壓力為100 bar,萃取時間為3 min,兩個靜態循環。萃取完成后,用UPLC-MS/MS檢測。平均回收率為86.8%～101.5%,RSD低于7.7%;LOD為0.03～0.5 μg/kg,LOQ為0.1～2.0 μg/kg。徐萬邦等[12]基于SWE,開發了一種用于測定動物源性食品中氯霉素、土霉素和四環素的快速分析方法。方法的回收率在92.1%～104.8%之間,RSD值在0.3%～0.5%之間。

1.5 固相萃取(Solid-phase extraction,SPE) 與LLE相比,SPE具有不需要使用大量有機溶劑,處理過程中不會出現乳化現象,樣品處理簡單,耗時短等特點。SPE中關鍵步驟是固相萃取吸附劑的選擇,吸附劑可以影響選擇性、親和性以及容量。目前,用于CAPs殘留分析的SPE柱填料種類較多,主要有C18、HLB、MCX、Chem Elut、Florisil和硅膠等,目前常用的萃取柱見表1。

表1 酰胺醇類藥物常用的固相萃取柱Tab 1 Solid phase extraction columns commonly used for amphenicols drugs

1.6 基質固相分散萃取(Matrix solid-phase dispersion,MSPD) MSPD是將涂有C18等多種聚合物的固相萃取材料與樣品一起研磨,制得半干狀態的混合物并將其作為填料裝柱,然后采用類似SPE的方法,用不同的溶劑淋洗萃取柱,將各種待測物洗脫。MSPD是在SPE基礎上改進后的處理方法,與SPE比較,其優點在于:濃縮了傳統樣品前處理過程中的提取和凈化過程,操作簡單。

Pan等[22]建立了基于MSPD的UPLC-MS/MS方法測定魚肉中的CAP、TAP和FF的含量。肌肉組織與C18分散劑混合研磨,制成固相萃取柱,用乙腈-水(50:50,V/V)洗脫。CAP、TAP和FF的CCα和CCβ范圍分別為0.02～0.06 μg/kg和0.11～0.16 μg/kg,平均回收率為84.2%～99.8%,RSD低于16.6%。Tao等[23]建立了測定蝦和魚中CAP、TAP、FF和FFa的LC-MS/MS(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法。樣品采用MSPD萃取凈化,將樣品與C18填料混合裝入MSPD柱。方法的CCα和CCβ分別為0.01～0.09 μg/kg和0.04～0.25 μg/kg,回收率為83.8%～98.8%,RSD低于13.7%。

1.7 磁性固相萃取法(Magnetic solid-phase extraction,MSPE) 磁性固相萃取技術是以磁性或可磁化的材料作為吸附劑的一種分散固相萃取技術。在MSPE過程中,磁性吸附劑不直接填充到吸附柱中,而是被添加到樣品的溶液或者懸浮液中,將目標分析物吸附到分散的磁性吸附劑表面,在外部磁場作用下,目標分析物隨吸附劑一起遷移,最終通過合適的溶劑洗脫被測物質,從而與樣品的基質分離開來。相較常規DSPE填料相比,納米顆粒的比表面積大,擴散距離短,具有非常高的萃取能力和萃取效率。Vuran等[24]使用MSPE方法提取并凈化牛奶樣品中的CAP,高效液相色譜-二級線性陣列檢測器法(High-performance liquid chromatography-diode array detector,HPLC-DAD)檢測。作者首先合成了磁性碳納米纖維,將其作為吸附劑用于吸附CAP。樣品用緩沖液提取,離心后,提取液中加入制備好的磁性碳納米纖維吸附CAP,用ACN:MeOH(1∶1,V/V)洗脫。方法的LOD為3.02 μg/L,回收率為94.6%～105.4%,RSD低于4.0%。Zhang等[25]制備了一種新型的適配體修飾的磁性介孔碳,用于MSPE方法凈化魚和雞肉樣品中CAP。方法LOD為0.94 pmol/L,回收率為87.0%～107%,RSD為3.1%～9.7%。Huang等[26]合成了一種新型核酸適配體功能化磁性吸附劑,用于選擇性富集食品中的CAP、TAP和FF。首先采用溶膠-凝膠法合成磁性二氧化硅包覆的Fe3O4微球(Fe3O4@SiO2),然后加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APTES)試劑形成Fe3O4@SiO2-NH2,再與琥珀酸酐反應形成Fe3O4@SiO2-COOH,最后加入EDC/磺基-NHS偶聯劑,合成了一種非常穩定的吸附劑,用于檢測CAP、TAP和FF。該吸附劑基于適配體對分析物的高親和力,可以特異性地同時識別并富集一些復雜食品基質中的CAP、TAP和FF。

1.8 QuEChERS方法 QuEChERS(Quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)具有快速、簡便、價廉、高效、耐用和安全等優點。近年來在動物源性食品中獸藥等殘留檢測領域應用廣泛。Mou[27]采用QuEChERS方法提取禽肉和牛肉中CAP。樣品用水∶乙腈(1∶1,V/V)提取,MgSO4、PSA和C18吸附劑凈化,UPLC-MS/MS的分析方法測定。LOD和LOQ分別為0.16 μg/kg和0.50 μg/kg,回收率為99%～111%,RSD為0.48%～12.48%。趙浩軍等[28]采用QuEChERS方法提取豬肌肉中CAP和FF。以乙腈為提取溶劑,正己烷除脂,C18吸附劑凈化,LC-MS/MS測定。方法LOD為0.1 μg/kg,回收率為81.1%～115.8%,RSD為4.2%～11.8%。Jung等[29]利用LC-MS/MS同時檢測牛肉、豬肉、雞肉、蝦、鰻魚和比目魚中的CAP、TAP、FF和FFa。通過QuEChERS萃取方法進行萃取,PSA和MgSO4進行樣品凈化。回收率為64.26%～116.51%,LOQ為0.02～10.4 μg/kg。

1.9 分子印跡技術(Molecular imprinting technology,MIT) MIT是將要分離的目標分子與功能單體通過共價或非共價作用進行預組裝,與交聯劑共聚物制備得到聚合物。分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer,MIP)制備簡單,能夠反復使用,機械強度高,穩定性好。因此,非常適合用于SPE的填充劑或SPME的涂層填料或DSPE的吸附劑來分離復雜樣品中的分析物。Samanidou等[30]以CAP為模板分子,3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和三乙氧基苯基硅烷(Triethoxyphenyl silane,TEPS)為功能前體,原硅酸四甲酯(Tetramethyl orthosilicate,TMOS)為交聯劑,異丙醇為溶劑/致孔劑,鹽酸作為溶膠-凝膠催化劑,合成印跡溶膠-凝膠二氧化硅基無機聚合物吸附劑(溶膠-凝膠MIP)。合成的MIP作為萃取牛奶中CAP分子印跡固相萃取(Molecularly imprinted solid-phase extraction,MISPE)的吸附劑,LC-MS檢測。方法RSD小于13%,回收率為85%～106%。Jia等[31]以CAP作為模板,甲基丙烯酸為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene glycol dimethacrylate,EGDMA)為交聯劑和偶氮二異丁腈(Azobisisobutyronitrile,AIBN)為引發劑,甲醇-乙酸(8:2,V/V)為溶劑/致孔劑,合成了MIP(CAP-MIP),用于檢測雞肉、豬肉和魚肉中的CAP。方法的LOD為5.0 pg/g,回收率為71.5%～94.4%。Li等[32]建立了一種以磁性分子印跡聚合物(Magnetic molecularly imprinted polymer,MMIPs)為SPE吸附劑,選擇性地提取食品中CAP的分析方法。由修飾的Fe3O4磁性納米顆粒為支撐材料,CAP為模板分子,甲基丙烯酸/或丙烯酰胺為功能單體,EGDMA為交聯劑,AIBN為引發劑,制備了MMIPs。方法LOD為10 μg/L,回收率為95.31%～106.89%。該方法的優點在于選擇性強、靈敏度高、可重復利用等,但該方法僅限于單一化合物的檢測,不適于同時檢測基質中多種化合物。

1.10 織物相吸附萃取(Fabric phase sorptive extraction,FPSE) 織物相吸附萃取(FPSE)是一種新一代綠色微萃取技術,通過溶膠-凝膠法將吸附劑化學鍵合在具有大量活性基團的織物基材表面,可顯著提高涂層的熱穩定性、化學穩定性和溶劑穩定性。FPSE是一種高效、簡單、快速、綠色的微萃取技術。Samanidou等[33]利用FPSE提取凈化原料奶中的TAP、FF和CAP。使用短鏈聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)創建了一種高極性聚合物涂層FPSE介質。TAP、FF和CAP回收率分別為44%、66.4%和81.4%。Chu等[34]開發出一種基于填充納米纖維固相萃取(Solid phase extraction of filled nanofibers,PFSPE)方法,用于測定牛奶中的CAP。采用靜電紡絲法制備了聚苯乙烯-聚乙烯吡咯烷酮(Polystyrene polyethylene pyrrolidone,PS-PVP)復合納米纖維。方法回收率為97.5%～104.0%,LOD為0.2 μg/L。

綜上所述,LLE、ATPS、DLLME、SWE、ASE、SPE、MSPD等是國內外動物性食品中酰胺醇類獸藥殘留常見樣品前處理技術,它們具體的優缺點見表2。

表2 動物性食品中酰胺醇類獸藥殘留10種常見樣品前處理技術優缺點比較Tab 2 Comparison of the advantages and disadvantages of 10 common sample pre-treatment techniques for amphenicols drugs residues in animal food

2 展 望

酰胺醇類藥物被廣泛地應用于畜禽以及水生動物疾病的預防、治療等其他方面,對畜牧業的發展起到重要的作用,但不合理的使用易造成動物源性食品中獸藥的殘留。此外,一定比例的藥物以母體藥物或代謝物的形式通過糞便和尿液的排出進入環境中,對環境以及人類健康造成嚴重威脅。現如今,雖然色譜、質譜分離檢測技術得到了很大的改善,但高效的樣品前處理技術對于分析的準確度、目標化合物的響應以及前處理時間的長短影響很大。優秀的樣品前處理方法能節約分析時間、最大程度去除基質干擾并使分析結果更加準確,從而獲得可靠的檢測數據。目前,對于動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物的樣品前處理技術有ATPS、DLLME、SWE、ASE、SPE、MSPD、MSPE、QuEChERS、MIT、FPSE等方法,已經逐步取代傳統的樣品前處理法。酰胺醇類藥物及其代謝物的樣品前處理技術逐漸向自動化、更少的溶劑使用量、更高的樣品分析通量以及更適合于復雜基質的方向發展。