超高效液相色譜法測定原料藥中泰地羅新的含量

湯文利 ,郭玉秋,李有志,趙延東,魏秀麗,王艷芬,趙曉雨,梁 萌,門曉冬,宋祥彬

(1.山東省飼料獸藥質量檢驗中心,山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室,濟南 250100;2.山東省蛋雞技術創新中心,濟南 250102;3.山東久隆恒信藥業有限公司,山東德州251100)

目前,呼吸系統的高發病率和死亡率是全球豬、牛養殖業面臨的主要問題[1-4],我國用于治療和預防豬、牛呼吸道疾病的大環內醋類藥物主要是泰樂菌素、替米考星,但隨著長時間的使用,各地都發生了不同程度的耐藥現象,且出現多次給藥才能見效、用量大、殘留多等問題。

泰地羅新作為全新的大環內酯類抗生素產品,是泰樂菌素的衍生物,CAS號328898-40-4,分子式為 C41H71N3O8,熔點為192 ℃,溶于極性有機溶劑 (如丙酮、甲醇等),水中微溶[5],結構式見圖1。泰地羅新在生產加工及貯藏過程中會產生泰地羅新異構體,結構式見圖2。在中華人民共和國農業農村部公告第391號中含量測定項下,明確規定按外標法以泰地羅新主峰和泰地羅新異構體峰的峰面積之和計算其含量,且由于泰地羅新異構體分子結構、烯醇式理化性質與泰地羅新存在差異,為了控制藥物質量、優化藥物制劑工藝,均需檢測泰地羅新異構體,公告中在有關物質項下規定按峰面積歸一化法計算,異構體不得超過2%。

圖1 泰地羅新Fig 1 Tildipirosin

圖2 泰地羅新異構體Fig 2 Tildipirosin isomer

泰地羅新對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌均有較強的抗菌活性[6-8],尤其對引起豬、牛呼吸道系統疾病的病原菌尤為敏感[9-11],對豬、牛的呼吸道疾病具有十分明顯的治療效果,藥效強于泰樂菌素和替米考星,而且具備動物專用、用量少、一次給藥全程治療、超長的消除半衰期、生物利用度高和低殘留等眾多優點[12]。將可以替代泰樂菌素、替米考星以及部分替代氟苯尼考等現用獸藥的市場份額,對于遏制耐藥性行動、保證畜牧業健康發展具有重要意義。

目前,農業農村部公告第391號中采用高效液相色譜法檢測泰地羅新原料中泰地羅新的含量,本文檢測泰地羅新主峰相對保留時間23 min,異構體峰保留時間26 min,公告規定運行時間為主峰保留時間的2.5倍,耗時較長,流動相使用量較大,且泰地羅新主峰及異構體峰分離度低。因此,本文研究了超高效液相色譜法(UPLC)對泰地羅新進行快速定量檢測,大大縮短了檢測時長,提高了檢測效率,降低了流動相的消耗,減少了環境污染。流動相體系穩定,超高效方法專屬性、重現性、精密度、線性和準確度良好,色譜峰不拖尾、分離度和理論塔板數高,為準確、快速控制泰地羅新質量提供檢測依據。

由于泰地羅新含量是通過主峰和異構體峰面積之和進行計算,但此前專利及相關文獻報道,均未對泰地羅新異構體峰進行考察,色譜圖中也無異構體峰檢出。本文對主峰和異構體峰均進行了考察,以異構體峰確定方法檢測限、定量限,并對其與主峰的分離度等方面進行了檢測,使試驗更加科學準確、數據可靠。

1 材料與方法

1.1 試劑 泰地羅新對照品,含量99.3%,購自中國獸醫藥品監察所;泰地羅新原料,購自山東久隆恒信藥業有限公司;乙腈(色譜純);磷酸二氫鉀(分析純);超純水;

1.2 儀器 WATERS ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀(美國waters公司,配二極管陣列檢測器);Waters E2695 高效液相色譜儀(美國waters公司,配二極管陣列檢測器)。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備 取供試品75 mg,精密稱定,置50 mL棕色量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成1.5 mg/mL的溶液,經0.45 μm的微孔濾頭過濾。

1.3.2 對照品溶液制備 取對照品75 mg,精密稱定,置50 mL棕色量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成1.5 mg/mL的溶液,經0.45 μm的微孔濾頭過濾。

1.3.3 標準儲備液的制備 精密稱取泰地羅新對照品150 mg(折含量后),加乙腈溶解,并定容至50 mL,配制成3 mg/mL儲備液。

1.3.4 線性關系考察 取標準儲備液(1.3.3)適量,配制成每1 mL含泰地羅新0.2、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 mg的標準工作液。

1.3.5 UPLC測定下色譜操作條件及參數 色譜柱:BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相:0.05 mol/L磷酸氫二鉀緩沖液(磷酸調pH值至8.2)-乙腈(45∶55);二極管陣列檢測器,掃描范圍:190～400 nm,檢測波長:289 nm;柱溫:40 ℃;流速:0.5 mL/min;進樣量:1 μL。結果按外標法,以泰地羅新主峰和泰地羅新異構體峰的峰面積之和進行計算。

1.3.6 UPLC測定下重復性試驗 取同一批泰地羅新原料,按“1.3.1”項下平行制備6份供試品溶液,在“1.3.5”條件下進行分析,計算其峰面積RSD。

1.3.7 UPLC測定下精密度試驗 取一份1.5 mg/mL泰地羅新對照品溶液,按1.3.5色譜條件下重復進樣6次,計算峰面積RSD。

1.3.8 UPLC測定下檢測限和定量限 取泰地羅新的標準工作液,逐級稀釋進樣,按上述方法測定,以泰地羅新異構體峰的信噪比S/N≥3作為檢測限、S/N≥10 作為定量限。

1.3.9 不同色譜條件樣品檢測比較 取同一份樣品,分別參照農業農村部公告第391號中的方法使用高效液相色譜儀和1.3.5色譜條件下使用超高效液相色譜儀進行檢測,對比泰地羅新的含量和色譜參數。

1.3.10 穩定性試驗 取同一供試品溶液,于室溫下0、2、4、6、8、12、24 h,按“1.3.4”項下方法進樣,計算峰面積RSD。

2 結果與分析

2.1 色譜分離 按照1.3.5的色譜條件,使用超高效液相色譜儀測定,泰地羅新對照品和泰地羅新原料樣品色譜峰峰形良好,分離度高,主峰保留時間約為4.5 min,異構體峰保留時間約為5.0 min。

2.2 線性 根據色譜圖以濃度為橫坐標,主峰和異構體峰面積之和為縱坐標分析得出,泰地羅新在0.2～2.4 mg/mL的濃度范圍內具有良好的線性關系,線性回歸方程為y=3.52×106x-1.81×104,R2=0.9992。其標準曲線見圖3。

2.3 重復性試驗 取同一批泰地羅新原料,平行制備6份供試品溶液,進樣,以泰地羅新主峰和泰地羅新異構體峰的峰面積之和計算,測得泰地羅新峰面積RSD為0.69%,滿足實驗要求。

2.4 精密度試驗 取1.5 mg/mL泰地羅新對照品溶液,重復進樣6次,以泰地羅新主峰和泰地羅新異構體峰的峰面積之和計算,測得泰地羅新峰面積的RSD為0.12%,滿足實驗要求。

2.5 檢測限和定量限 以泰地羅新異構體峰的信噪比S/N≥3作為檢測限、S/N≥10 作為定量限。

結果表明檢測限為0.2 mg/mL,定量限為0.6 mg/mL(圖4、圖5)。

圖4 0.2 mg/mL泰地羅新原料色譜圖(UPLC 1 μL)Fig 4 0.2 mg/mL tildipirosin drug substance chromatogram (UPLC 1 μL)

圖5 0.6 mg/mL泰地羅新原料色譜圖(UPLC 1 μL)Fig 5 0.6 mg/mL tildipirosin drug substance chromatogram (UPLC 1 μL)

2.6 UPLC和HPLC色譜條件下樣品檢測結果的比較 UPLC和HPLC色譜條件下的主成分平均理論塔板數、保留時間、拖尾因子等參數的比較見表1。

表1 UPLC和HPLC色譜條件下的主成分不同色譜參數的比較Tab 1 Comparison of different chromatographic parameters of principal components under UPLC and HPLC chromatographic conditions

由表1可見,UPLC較HPLC色譜條件下,理論塔板數和分離度提高,拖尾因子、保留時間和運行時間大大降低,減少了所消耗的流動相的體積,完全滿足檢測要求且效率大幅提升。

下圖6-圖7為泰地羅新對照品UPLC和HPLC檢測光譜圖,圖8-圖11為1.5 mg/mL泰地羅新對照品及原料的UPLC和HPLC檢測色譜圖。

圖6 泰地羅新對照品UPLC光譜圖Fig 6 UPLC spectrogram of tildipirosin control

圖7 泰地羅新對照品HPLC光譜圖Fig 7 HPLC spectrogram of tildipirosin control

圖8 1.5 mg/mL泰地羅新對照品UPLC色譜圖(1 μL)Fig 8 UPLC chromatogram of 1.5 mg/mL tildipirosin control(1 μL)

圖9 1.5 mg/mL泰地羅新原料UPLC色譜圖(1 μL)Fig 9 UPLC chromatogram of 1.5 mg/mL tildipirosin drug substance(1 μL)

圖10 1.5 mg/mL泰地羅新對照品HPLC色譜圖(10 μL)Fig 10 HPLC chromatogram of 1.5 mg/mL tildipirosin control(10 μL)

圖11 1.5 mg/mL泰地羅新原料HPLC色譜圖(10 μL)Fig 11 HPLC chromatogram of 1.5 mg/mL tildipirosin drug substance(10 μL)

根據表2,使用高效液相色譜儀(參照農業農村部公告第391號)和超高效液相色譜儀(1.3.5色譜條件),對同一樣品中泰地羅新的含量分別進行比較,相對偏差小于1%,說明超高效液相色譜法可行有效,結果準確。

表2 UPLC和HPLC色譜條件下泰地羅新含量檢測結果Tab 2 Results of content determination of tildipirosin under UPLC and HPLC conditions

通過保留時間和運行時間等方面,選擇超高效液相色譜法(UPLC)更加高效。從樣品理論塔板數、拖尾因子和分離度等方面,選擇超高效液相色譜條件,理論塔板數更高,主峰與異構體峰的分離度更好。

2.7 穩定性試驗 以泰地羅新主峰和泰地羅新異構體峰的峰面積之和計算,測得泰地羅新峰面積的RSD為1.0%,說明供試品溶液穩定,實驗條件滿足要求。

3 討論與結論

3.1 波長選擇 在本試驗條件下,利用超高效液相色譜儀PDA檢測器對泰地羅新對照品溶液在波長210～400 nm 范圍內進行掃描,采集其光譜圖,得到泰地羅新在289 nm左右有最大吸收,此與農業農村部391號公告中檢測波長一致,相較個別專利中設定的216 nm的波長,提高了檢測準確性。

3.2 異構體峰的考察 泰地羅新含量是通過主峰和異構體峰面積之和進行計算,但據此前專利及相關文獻報道,均未對泰地羅新異構體峰進行考察,色譜圖中也無異構體峰檢出。本文對主峰和異構體峰都進行了考察,在重復性(RSD為0.69%)、精密度(RSD為0.12%)和穩定性(RSD為1.0%)等方面進行了檢測,并以異構體峰確定方法檢測限(0.2 mg/mL)和定量限(0.6 mg/mL),使試驗科學準確、數據可靠。

3.3 與農業農村部公告第391號[13]結果對比 采用高效液相色譜法和超高效液相色譜法對不同批次泰地羅新原料進行含量測定,相對偏差都小于1%。在本試驗條件下,超高效液相色譜法的優勢:1、本方法流速為0.5 mL/min,運行時間10 min,每針運行僅需要5.0 mL流動相,與高效色譜法每針運行需56 mL流動相相比,大大縮短檢測用時,節約了試劑、耗材,提高了檢測效率,使流動相用量極大減少,廢液處理的成本降低,減少了環境污染。2、高效液相色譜法進樣量為10 μL或20 μL,本方法采用超高效液相色譜法,進樣量為1 μL,且進樣濃度較391號公告降低,減小色譜柱的損傷,降低檢測成本。3、超高效方法重復性、精密度、穩定性、準確度良好,色譜峰不拖尾,分離度高,理論塔板數高。

本文建立的超高效液相色譜法,準確、快速、環保,可以有效的對泰地羅新含量進行定性和定量的測定。