豬支原體肺炎疫苗效力檢驗常見問題與質量控制

劉 博,魏 津,馬 欣,王 甲,趙浩然,劉 燕,姚文生,羅玉峰

(中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

豬肺炎支原體是一類直徑小(400-1200納米),基因組小(893-920 kb)且缺乏細胞壁的細菌[1]。其引起的豬支原體肺炎是一種高度傳染性慢性疾病[2],在全世界范圍內流行,幾乎每個豬群中都可檢測到病原[3]。對該疾病的治療僅限于抗生素,但抗生素并不能完全消除感染。疫苗可以降低該病的嚴重程度,但不能完全預防感染的發生[4]。近年來,豬支原體肺炎疫苗是豬用疫苗的一個研發熱點,本文通過對檢驗過程中發現的問題進行系統分析,旨在幫助研發企業規避常見問題,提高豬支原體肺炎疫苗的質量,為疫病的預防提供保障。

1 豬肺炎支原體生物制品的發展現狀

豬肺炎支原體生物制品主要涉及診斷制品與疫苗。

1.1 豬支原體肺炎診斷制品 目前國內已經注冊的診斷制品有豬支原體肺炎微量間接血凝試驗(IHA)診斷試劑、豬肺炎支原體等溫擴增檢測試劑盒、豬肺炎支原體ELISA抗體檢測試劑盒以及豬肺炎支原體ELISA抗體(sIgA)檢測試劑盒。其中,IHA診斷試劑是將肺炎支原體抗原附著于紅細胞表面,成為致敏的載體,隨后與待檢血清反應,如果血清抗體陽性則出現可見的凝集反應[5]。豬肺炎支原體等溫擴增檢測試劑盒是通過環介導等溫擴增反應(lamp)對樣品中支原體核酸進行檢測,待檢樣本通常為鼻咽拭子[6]。ELISA抗體檢測試劑盒有針對性IgG、也有針對支原體粘膜免疫sIgA進行檢測的,檢測樣本為血清[7]。在國內注冊的進口試劑盒目前只有idexx的ELISA抗體檢測試劑盒。

1.2 豬肺炎支原體疫苗 目前已注冊的豬肺炎支原體相關疫苗,活疫苗有3個均為國產苗,滅活單苗國產7個,進口7個。其中豬支原體肺炎活疫苗是我國首個預防豬支原體肺炎的活疫苗,其生產用菌種為豬肺炎支原體兔化弱毒株,該菌株由豬肺炎支原體強毒株經致弱后制成;活疫苗由于免疫的方式原因(胸腔注射),注射技術要求高,在使用環節難以推廣,但是免疫保護效果確實,豬支原體肺炎活疫苗在效力檢驗中免疫組肺炎病變減少率可達到100%。目前涉及支原體的聯苗均為豬圓環支原體二聯滅活疫苗,國產3個,進口2個。首個聯苗在國內于2020年獲批生產及使用。

1.3 豬肺炎支原體疫苗的生產(批簽發)情況 從批簽發數據來看,2017年及以前,進口疫苗在我國對豬支原體肺炎的預防中是占據絕對優勢的,但是2017年以后差距逐年在縮小,2020年,國產豬肺炎支原體疫苗的批簽發量已經實現了反超。至2021年,國產苗和進口苗批簽發量的差距還在拉大,造成差距的主要原因就是豬圓支二聯疫苗,這也是近年來研發注冊的一個熱門。

產品的研發熱是因為市場存在需求,目前國內中大型養殖場對于支原體疫苗的免疫幾近100%(小型養殖場或者散戶對于豬肺炎支原體的重視還有待加強)。作為使用者,產品質量過硬可以保證養殖效益;作為研發者和檢驗人員,確保疫苗的效力對于把控好產品的質量尤其重要。

表1 2017-2021年豬肺炎支原體疫苗批簽發統計Tab 1 Mycoplasma Hyopneumoniae Vaccine Batch Release Statistics, 2017-2021

2 豬支原體肺炎疫苗效力檢驗常見問題

豬支原體肺炎疫苗的效力檢驗分為靶動物免疫攻毒法與替代方法,替代方法分別為活菌計數、相對效力檢測與血清學方法。

2.1 活菌計數 活菌計數,是通過對活疫苗本身的活菌進行計數,通過抗原含量來評價疫苗的免疫效力。在研發過程中建立好活菌數和疫苗免疫效力的關系。這個方法操作簡單成本低。活菌計數結果偏差性較大,因為每一個稀釋度只接一個小管,尤其到了高稀釋度的時候,本身菌液濃度就已經很低,如果此時稀釋取樣不均勻,就會直接影響最后的結果。目前部分實驗室在研究過程中會引入病毒TCID50測定方法,到了高稀釋度時設置重復,再用統計學方法對結果進行統計,以獲取更準確的結果。另一個對活菌計數有較大影響的因素是培養基的質量,支原體培養基成分復雜,影響因素較多,企業應建立培養基質量內控方法,用經過品控的培養基保證結果的可信度[8]。

2.2 相對效力檢測 相對效力檢測是近年來滅活疫苗常用的效力檢驗替代方法。這個方法最早出現在進口產品中,目前在國內銷售的7個進口產品效力檢驗均有此方法;國產疫苗近年來也開始針對這個方法展開研究,目前有3個產品效力檢驗用到相對效力檢測。這個方法主要是通過ELISA,對豬肺炎支原體疫苗生產株的某一個保護型抗原含量進行測定,同時和經靶動物免疫攻毒試驗檢驗合格的參考疫苗進行比較,通過軟件計算相對的抗原含量,并以此評價疫苗的免疫效力。針對保護性抗原的選擇,最重要的原則在于,該保護性抗原和疫苗的效力需要有很好的相關性。具體到每一個產品,由于生產用菌株不同,所以對保護性抗原的選擇也有所不同,企業在研發過程中需要進行摸索嘗試,建議可以從豬肺炎支原體膜蛋白著手。該方法試驗周期短,需對樣品進行處理,不同的疫苗在此步差別比較大,部分疫苗需要凍融后經過超聲波處理和長時間超速離心,而部分企業由于對實驗條件和方法的優化,已經可以將疫苗經過凍融之后直接測定,極大縮短了檢驗的時間。

這種替代方法,出現過本參數合格的情況下存在免疫攻毒法不合格的情況。研究單位在選擇適合的保護性抗原建立平行關系的時候,參考疫苗的質量也非常重要。只有確保參考疫苗本身可通過靶動物免疫攻毒法檢測的情況下,結果才有意義。

圖1 相對效力檢測結果Fig 1.Result Layout of Relative Potency Test

2.3 血清學方法 血清學方法,是豬肺炎支原體疫苗效力檢驗最常見的一種替代方法。具體檢驗時,實驗動物以兔最為常見,也有用小鼠、豚鼠和豬的,免疫后采血通過IHA測定血清效價。這個方法在國內相對主流一些,國產疫苗有5個均使用此方法作為效檢替代方法,進口產品中有一個使用血清學方法,但未采用間接血凝,而是用的競爭ELISA。因為不用攻毒,而且替代動物比較好獲取,所以本方法試驗周期短、成本低。IHA方法存在兩個主要問題,一是近年來的檢驗工作中,經常出現生產企業提供的IHA試劑質量不穩定,具體體現在抗原容易出現自凝;另外一個問題是,出現過血清學方法保護,但是本動物免疫攻毒法不保護的結果。

在研發過程中,研究單位應該一方面重點注意IHA試劑的穩定性,另一方面進一步研究平行關系的建立。

2.4 免疫攻毒法 免疫攻毒法通過對健康易感豬進行免疫攻毒試驗,在試驗周期結束后對實驗豬進行剖檢和肺臟病變評分,計算免疫組的相對保護率。該方法經濟成本高,周期長,卻是評價產品質量最具說服力的方法。效力檢驗免疫攻毒法也是近年來不合格項出現最多的參數,常見不合格項就是免疫組保護率不符合要求。通過對近年來注冊的產品進行系統梳理,該方法存在的主要問題有4點:分別是健康易感豬的標準不統一,攻毒菌株的毒力標準不統一,對照成立條件不統一,產品間保護率差距大(62～90%)。

具體來說,①健康易感豬的標準,有一些制品尤其是部分圓支二聯苗,對豬的要求非常高,導致健康動物的篩選非常困難,然而也有一些圓支二聯苗,對于健康豬篩選只要求豬肺炎支原體抗體陰性。通常豬背景越干凈,判定的時候越簡單,因為這類肺臟不易出現繼發感染一類影響判定的情況。因此在一定程度合理把控健康易感豬的標準,是有必要的,應當對處于流行態勢的呼吸道病原進行篩選。②針對攻毒菌株的毒力標準不統一,在近年來注冊的產品中,大部分以最小感染劑量MID為單位來確定攻毒劑量;也有部分企業,在質量標準中單純用肺組織克數確定攻毒劑量。對于肺組織克重確定毒力的情況,存在的主要問題為批次間差異較大。動物的個體差異極易導致相同克重下毒力的差異。從檢驗的角度來說我們更提倡測定MID,并以此作為標尺對攻毒劑量進行確定。③針對檢驗過程中對照而言,目前一部分疫苗對于對照成立的條件沒有任何規定,一部分疫苗對對照評分的下限做出了規定,少數疫苗對上下限都做出了規定。對照成立條件不統一,對產品質量的橫向評價非常不利。在免疫組評分固定的時候,對照的分數直接影響保護率的結果。目前在評審和檢驗過程中,常見的對照評分為對照組平均評分不低于10分(55分法)以及8分(28分法)。④針對產品間質量差距大,近年來檢驗發現保護率好的疫苗相對保護率可以達到90%以上甚至超過95%,而保護率一般的疫苗只能剛剛過合格線。企業應當從對生產用菌株的篩選、抗原含量、工藝等多方面進行優化,提高疫苗的保護率。

3 結 語

豬肺炎支原體與其它呼吸道疾病原的共感染給養殖業造成了巨大的損失[9]。作為從業人員,生產者需要生產出安全高效的疫苗,檢驗人員應當通過建立標準方法保證效力檢驗結果的可靠性從而保障養殖業健康發展。

活疫苗由于可以有效地激活細胞免疫,對于豬肺炎支原體這類通過黏膜感染的胞內寄生菌具有非常好地保護作用,然而存在毒力返強的安全隱患且不利于疫病的凈化。滅活疫苗通過激活體液免疫產生高滴度的抗體,然而針對胞內寄生菌,抗體并非是百分之百的保護傘。近年來,有研究人員利用輻照的方法對細菌進行滅活并用于免疫,這類抗原不會增殖,但能保留一定程度的代謝活性且能有效激活細胞免疫,較單純的化學滅活疫苗而言更具優勢,是支原體類疫苗未來可以考慮的一個研究方向[10, 11, 12]。

對于豬肺炎支原體疫苗效力檢驗的優化方向,總體來說就是標準化。通過建立質量穩定的IHA診斷試劑,解決檢驗過程中診斷試劑質量不穩定的問題。通過參考疫苗質量評價標準化和攻毒菌株、對照成立條件標準化,解決多菌株疫苗質量難以橫向評價的問題。以期在未來可以以更規范更標準的尺度去評價和保障疫苗的質量。