獸用中藥化學對照品的研究思路與展望
——以甘草苷為例

張 璐,范 強,龔旭昊

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

國家藥品標準物質(zhì)分為標準品、對照品、對照藥材、對照提取物和參考品等五類[1],目前,獸用中藥標準物質(zhì)有化學對照品和對照藥材供應,其中化學對照品原料多從天然產(chǎn)物中提取精制而成,特點是結(jié)構(gòu)復雜、制備困難、標定難度大。甘草苷是中藥甘草的主要有效成分,也是評價甘草質(zhì)量的指標性成分,在《中國獸藥典》(2015年版)(以下簡稱獸藥典)中用于甘草及含甘草制劑的含量測定等[2],在獸用中藥產(chǎn)品檢驗、科研及新藥研發(fā)中應用廣泛。本文擬以首批甘草苷獸用中藥對照品為例,分析獸用中藥對照品在標定賦值過程中遇到的常見問題,提出相應的解決方法,為獸用中藥化學對照品的標定和使用提供思路和技術(shù)支持,并對未來發(fā)展方向進行展望。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Waters e2695 高效液相色譜儀,配置Waters 2489 雙通道紫外檢測器、Waters 2998 二極管陣列檢測器(PDA)、Empower2色譜工作站軟件;電子分析天平:感量0.00001 g;紫外分光光度計;傅里葉紅外光度計;干燥箱;高溫爐;卡氏水分測定儀;CAMAG REPROSTAR 3成像系統(tǒng)等;雙槽展開缸;硅膠 G 薄層板 (10 cm×20 cm);乙腈,色譜純,購自默克公司;甲醇、冰醋酸等試劑均為分析純,購自國藥化學試劑有限公司;水由實驗室 MILLI-PORE 超純水儀自制。

1.2 試藥 甘草苷原料(批號ZQ1908017)由天津正清生物科技有限公司從豆科植物甘草Glycyrrhiza glabra L. 的干燥根和根莖經(jīng)提取、分離、純化制得;甘草苷對照品(批號111610-201908)購自中國食品藥品檢定研究院。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

天然產(chǎn)物中化學成分數(shù)量繁多、結(jié)構(gòu)復雜,相同分子式的化合物還存在立體異構(gòu)、構(gòu)造異構(gòu)等現(xiàn)象。由于獸用中藥化學對照品從天然產(chǎn)物中提取精制獲得,為確保對照品源頭準確,結(jié)構(gòu)鑒定工作尤為重要。獸用中藥化學對照品均為已知化合物,通常結(jié)合紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、1H NMR、13C NMR等譜學測試分析。甘草苷為二氫黃酮類化合物,結(jié)構(gòu)相對簡單(圖1),因此,研究中采用紫外光譜鑒別、紅外光譜鑒別,同時結(jié)合氫譜、碳譜,對甘草苷結(jié)構(gòu)進行了確證。對于一些結(jié)構(gòu)復雜的成分,仍需進一步的譜學分析。例如地榆皂苷Ⅰ、通光散苷A、巴戟天寡糖5聚糖等三萜皂苷、甾體皂苷和寡糖等類成分,還需要結(jié)合2D NMR(HSQC、HMBC、1H-1H COSY)、NOE、NOESY等核磁技術(shù),以準確鑒定糖苷鍵連接位置及構(gòu)型等信息[3]。又如一些黃酮碳苷類成分夏佛塔苷等,由于結(jié)構(gòu)中碳碳鍵旋轉(zhuǎn)位阻,導致其常溫核磁氫譜信號缺失,難以進行結(jié)構(gòu)解析,需采用升溫核磁技術(shù),通過升高測定溫度,降低碳碳單鍵旋轉(zhuǎn)能壘,從而獲得清晰的氫譜信號以進行結(jié)構(gòu)鑒定[4]。

中國堅持打開國門搞建設。開放已經(jīng)成為當代中國的鮮明標識。中國將堅定不移奉行互利共贏的開放戰(zhàn)略，將始終是全球共同開放的重要推動者、世界經(jīng)濟增長的穩(wěn)定動力源、各國拓展商機的活力大市場、全球治理改革的積極貢獻者。為進一步擴大開放，中國將在激發(fā)進口潛力、持續(xù)放寬市場準入、營造國際一流營商環(huán)境、打造對外開放新高地、推動多邊和雙邊合作深入發(fā)展方面加大推進力度。中國國際進口博覽會不是中國的獨唱，而是各國的大合唱。

圖1 甘草苷結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Structure diagram of Liquiritin

本文60例胸腹部占位性病變患者的收治時間為2017年9月—2018年9月，其中男性觀察對象30例，女性觀察對象30例，年齡27～78歲，平均（55.6±5.6）歲。均通過超聲、CT技術(shù)予以確定，為多發(fā)或單發(fā)胸腹部占位性病變。其中44例胸部穿刺（縱膈穿刺4例，肺部穿刺40例）、16例腹部穿刺（11例腎穿刺，5例肝穿刺）。均簽署研究同意書；通過醫(yī)學倫理委員會審查。

3 純度分析

獸用中藥化學對照品純度分析采用薄層色譜法與高效液相色譜法相結(jié)合方式。在薄層色譜法分析純度試驗中,應充分考察供試品的量、展開條件及顯色方式,以準確檢出雜質(zhì)斑點,并采用主成分自身對照法,對雜質(zhì)量進行初步判定。高效液相色譜法中,由于紫外、熒光、示差折光等檢測器的非通用性,通常采用面積歸一化法或主成分自身對照法進行純度分析檢測有機雜質(zhì)含量[8]。若化合物無紫外吸收,可使用蒸發(fā)光散射檢測器進行純度分析。

3.1 薄層色譜法檢查純度 在甘草苷原料薄層色譜法純度檢查試驗中,發(fā)現(xiàn)相同展開條件下,顯色方式會影響雜質(zhì)檢出。取展開后的薄層板,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視,可清晰檢出甘草苷主斑點,無雜質(zhì)檢出。噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰,置日光下檢視,可檢出甘草苷主斑點,也無雜質(zhì)檢出。又置紫外光燈(365 nm)下檢視,甘草苷主斑點顯色清晰,另檢出2個雜質(zhì)斑點(圖2)。

貧困地區(qū)一般集中連片，資源共享度較高，存在很大的合作空間。最好將幾個貧困村縣聯(lián)系起來總體規(guī)劃，在統(tǒng)籌發(fā)展的理念的制定下明確主導產(chǎn)業(yè)，并從中長期的角度分析主導產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)劣勢、外部機遇及挑戰(zhàn)，系統(tǒng)地思考整片貧困地區(qū)主導產(chǎn)業(yè)的發(fā)展策略，將扶貧產(chǎn)業(yè)納進地區(qū)整體產(chǎn)業(yè)的發(fā)展框架，促進協(xié)調(diào)各地區(qū)產(chǎn)業(yè)間的發(fā)展。

In ultraviolet light(365 nm) In daylight In ultraviolet light(365 nm)1,3,5-供試品溶液①(0.1 μg);2,4,6-供試品溶液②(10 μg)1,3,5-Sample solution①(0.1 μg);2,4,6-Sample solution②(10 μg)圖2 甘草苷原料薄層色譜圖Fig 2 The layer chromatogram of Liquiritin

照甘草苷原料薄層色譜鑒別方法,采用主成分自身對照,進行雜質(zhì)初步測定。取甘草苷原料約50 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(5 mg/mL)。精密量取供試品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液(0.5 mg/mL)。吸取對照溶液1 μL(0.5 μg)、2 μL(1 μg)、5 μL(2.5 μg)、10 μL(5 μg),供試品溶液20 μL(100 μg),點樣、展開、晾干、顯色、檢視。供試品色譜中出現(xiàn)2個雜質(zhì)斑點,其中1個雜質(zhì)斑點顏色淺于對照斑點顏色(0.5%),另1個雜質(zhì)斑點顏色與對照斑點顏色不同,無法比較深淺(圖3)。因此可初步判斷該批甘草苷原料至少含有兩種雜質(zhì),且一種雜質(zhì)量小于0.5%,但無法對雜質(zhì)量進行判定,需要采用高效液相色譜法進行進一步測定。

1-對照溶液0.5 μg(0.5%);2-對照溶液1 μg(1%);4-對照溶液2.5 μg(2.5%);6-對照溶液5 μg(5%);3,5-供試溶液100 μg(100%)1-Control solution 0.5 μg(0.5%);2-Control solution 1 μg(1%);4-Control solution 2.5 μg(2.5%);6-Control solution 5 μg(5%);3,5-Sample solution 100 μg(100%)圖3 甘草苷原料薄層色譜圖Fig 3 The layer chromatogram of Liquiritin

3.2 高效液相色譜法檢查純度 在甘草苷原料純度檢查試驗中,使用等度洗脫和梯度洗脫兩種色譜條件進行分析。取甘草苷原料10 mg置50 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。第一種色譜條件為:色譜柱Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈-0.5%冰醋酸溶液;流速為1.0 mL/min;檢測波長為276 nm;進樣量為10 μL;采集時間保留至甘草苷主峰保留時間的2.5倍,主成分峰與雜質(zhì)峰分離良好(圖4)。進樣供試品溶液,并隨行檢測限溶液(0.2 μg/mL)。兩名試驗人員分別進行獨立的純度檢查,按面積歸一化法計算,均值為99.03%(n=4)。

圖4 甘草苷原料高效液相色譜圖(等度洗脫)Fig 4 The high performance liquid chromatogram of Liquiritin(Isotropic elution)

在化學對照品的研制、標定過程中,世界衛(wèi)生組織(WHO)、美國藥典委員會(USP)、歐洲藥典委員會(EDQM)均采用質(zhì)量平衡法定值,即一個化學對照品的主成分、水分、有機溶劑、無機雜質(zhì)、有機雜質(zhì)含量的總和應為100.0%[9],獸用中藥化學對照品也照此法定值,同時采用外標法等進一步佐證[10]。

圖5 甘草苷原料高效液相色譜圖(梯度洗脫)Fig 5 The high performance liquid chromatogram of Liquiritin(Gradient elution)

4 水分測定和殘留溶劑

3)習題模塊：實現(xiàn)效果如圖5所示。點擊答題選項后，如果答題錯誤，則將錯誤答案標識成橙色、正確答案標識成綠色且將解析顯示；如果答案正確，則直接加載下一題。點擊右上角，可以選擇題目和查看此試卷中自己的答題情況。

1.2.2 錄像觀察法 反復觀看首屆女籃亞洲杯中國隊與冠亞軍隊的比賽錄像，對3支球隊的每場比賽進行觀察分析與統(tǒng)計，以提高所需數(shù)據(jù)的準確性，從而歸納出每支隊伍在進攻一端的技術(shù)特征。

甘草苷原料是甘草經(jīng)粉碎后有機溶劑回流提取,取提取液干燥粉碎,加入一定比例的有機混合溶液提取,收集提取液,加有機溶劑沉淀得固體,取濾過的固體用有機溶劑溶解后進行硅膠柱層析,取洗脫液,濃縮后用乙酸乙酯反復重結(jié)晶,制備得甘草苷。制備所用溶劑乙酸乙酯沸點為77 ℃,在105 ℃可完全揮發(fā),因此可以通過測定干燥失重來替代殘留溶劑與水分之和。

不同菌株的孢子懸浮液接種4～5齡馬尾松毛蟲幼蟲后，其累積死亡率變化見圖1。從圖1可知，馬尾松毛蟲幼蟲接種不同菌株后的累積死亡率差異較大。接種白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株的累積死亡率較高，死亡速度也快，接種12 d后，馬尾松幼蟲累積死亡率分別達到100%、90%，遠比其他菌株高。接種20 d后，除白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株外，其他菌株的累積死亡率最高為66.7%(白僵菌BbTA-01)，最低僅為15%(綠僵菌MaMXTR-01)。

4.1 水分測定 照獸藥典二部附錄9001獸藥引濕性試驗指導原則,測得甘草苷原料引濕增重為0.36%,表明其略有引濕性,在進行水分測定時無需過多關(guān)注環(huán)境濕度。照獸藥典一部附錄0981結(jié)晶性檢查法檢查,甘草苷晶粒呈現(xiàn)明暗交替的物象,表明其有結(jié)晶性,在進行水分測定時,需關(guān)注樣品溶解情況。采用費休氏法測得甘草苷原料水分均值為5.45%(n=2)。

4.2 干燥失重 照獸藥典二部附錄0831測定,兩名試驗人員測得甘草苷原料減失重量均值為5.81%(n=4)。

5 無機雜質(zhì)

獸用中藥化學對照品無機雜質(zhì)參照熾灼殘渣法測定。對于無機鹽形式存在的樣品,還需結(jié)合更為準確的離子色譜等技術(shù)測定無機離子實際含量[5]。甘草苷原料無機雜質(zhì)照獸藥典二部附錄0841測定,兩名試驗人員測得熾灼殘渣含量均值為0.24%(n=4)。

水分一般采用卡氏水分測定儀費休氏法測定,在應用該方法時,需特別關(guān)注樣品的引濕性和結(jié)晶性,避免因環(huán)境濕度高或樣品溶解不充分影響試驗結(jié)果,即在測定極具引濕性的樣品時,要注意環(huán)境除濕,避免環(huán)境濕度影響測定結(jié)果。若試驗中發(fā)現(xiàn)結(jié)晶性樣品溶解不好,應先研磨后再測定,以縮短滴定時間,保證結(jié)果準確。已知原料的殘留溶劑種類后,可采用氣相色譜法進行測定。如果樣品含未知殘留溶劑,可以采用熱重分析—氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)快速鑒定[9],該法可直接用于測定固定樣品,不但減少了有機溶劑的消耗,試驗過程也更加簡便、高效。

6 定 值

用另一種色譜條件對結(jié)果進行驗證。色譜條件為:色譜柱Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(A)—0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0～8 min,19%A,81%B;8～35 min,19→50%A,81→50%B;35～36 min,50→100%A,50→0%B;36～40 min,100→19%A,0→81%B);流速為1.0 mL/min;檢測波長為276 nm;進樣量為10 μL;采集時間保留至甘草苷主峰保留時間的2.5倍,主成分峰與雜質(zhì)峰分離良好(圖5),同時隨行檢測限溶液(0.04 μg/mL)。按面積歸一化法計算純度,均值為99.12%(n=2)。兩種色譜條件測得的純度值可互相印證。

根據(jù)《中藥化學成分提取分離手冊》[5]及相關(guān)文獻[6]記載,甘草苷在216 nm、276 nm和311 nm波長處有最大吸收。因此取甘草苷原料2 mg置100 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,照獸藥典二部附錄0401紫外—可見分光光度法檢測,結(jié)果表明該批甘草苷原料在以上3個波長處有最大吸收,與文獻資料記載一致。另采用溴化鉀壓片法,采集甘草苷原料和甘草苷對照品在4000～400 cm-1波段的紅外光譜圖,對二者進行比較。結(jié)果表明二者的紅外光吸收圖譜一致。在此基礎上,委托天津正清生物科技有限公司對甘草苷原料進行了1H NMR和13C NMR譜學測試,將獲得的甘草苷原料核磁信息與已知文獻比對,其數(shù)據(jù)與報道的化合物甘草苷(Liquiritin)信息一致[7]。綜上,認為本批甘草苷原料來源準確,確為甘草苷(分子式為C21H22O9,分子量M=418.39)。

6.1 質(zhì)量平衡法定值 用質(zhì)量平衡法對甘草苷原料定值,含量(%)=色譜純度×(100-干燥失重-無機雜質(zhì))/100,帶入數(shù)值,計算得甘草苷原料中甘草苷含量為(100-5.81-0.24)×99.00%/100=93.01%

6.2 液相色譜外標法定值 甘草苷含量測定方法來源于文獻[6],因此增加了方法適用性試驗。用PDA檢測器檢測甘草苷峰的純度,純度角度為0.031,純度閾值為0.227,純度角度小于純度閾值,說明在該色譜條件下,甘草苷是單一物質(zhì)峰,且溶劑空白在與主峰相應位置上無干擾,方法專屬性良好(圖6)。取甘草苷對照品10 mg,精密稱定,置200 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,進行6次測定,RSD值為0.3%,方法精密度良好。向甘草苷供試品溶液中精密加入甘草苷對照品,平行制備6份,計算回收率,測得的RSD值為0.94%,平均回收率為100.6%,方法準確度良好(表1)。取甘草苷對照品適量,配制成系列濃度的溶液,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得甘草苷回歸方程(n=7):Y=19260X+40719.93,r=1.00,甘草苷在12.5～800 μg/mL濃度范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線性關(guān)系。采用信噪比法,以信噪比為3∶1時相應濃度確定檢測限,以信噪比為10∶1時相應濃度確定定量限,該色譜條件下,甘草苷的檢測限為0.2 μg/mL、定量限為0.6 μg/mL。照液相色譜條件,兩名試驗人員各平行測定5份樣品,均值為93.10%(n=10),與質(zhì)量平衡法測得結(jié)果基本一致。

表1 加標回收率試驗數(shù)據(jù)表

a-溶劑空白溶液 b-供試品溶液a-Negative sample solution;b-Sample solution圖6 甘草苷原料高效液相色譜圖Fig 6 The high performance liquid chromatogram

7 討 論

獸用中藥化學對照品是獸用中藥材(飲片)、提取物、中成藥等檢驗檢測、標準研究、質(zhì)量控制的參比物質(zhì),用于判定獸用中藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣,對提高質(zhì)量控制水平、保障用藥安全有效具有重要作用,也影響著獸用中藥標準化、現(xiàn)代化發(fā)展。目前,還有很多獸用中藥材及其制劑無對照品供應,因此,制備高品質(zhì)的獸用中藥化學對照品以及進行規(guī)范的質(zhì)量標準研究具有較大的現(xiàn)實意義和學術(shù)價值。

獸用中藥化學對照品在未進行標定前需確定候選對照品,考察內(nèi)容有對照品的來源、制備工藝流程及相關(guān)參數(shù)等。同時,采用紫外—可見分光光度法、紅外光譜法、質(zhì)譜法、核磁共振波譜法等對候選對照品原料進行結(jié)構(gòu)確證。在此基礎上,采用薄層色譜主成分自身對照法、高效液相色譜歸一化法及主成分自身對照法檢測有機雜質(zhì)的含量,一般對照品原料要求純度不低于98.0%。定量用化學對照品采用國際通用的質(zhì)量平衡法賦值,再使用外標法等進一步佐證,以確保定值準確。發(fā)放使用中一般不設有效期,通過定期監(jiān)測有關(guān)物質(zhì)及含量來確保對照品質(zhì)量。

定值是獸用中藥化學對照品研制的關(guān)鍵一環(huán)。通過分析質(zhì)量平衡法定值公式及標定方法,可確定影響量值準確性的因素主要為參與定值計算的相關(guān)標定項,即水分、殘留溶劑、無機雜質(zhì)、有機雜質(zhì)的量值。隨著定量分析技術(shù)發(fā)展,可通過試驗引入水分、殘留溶劑、無機雜質(zhì)的不確定度,提高定值的準確性和科學性。然而當原料中主成分與雜質(zhì)紫外校正因子差異較大或色譜峰間分離效果差時,則無法準確測定有機雜質(zhì)的含量[8],可能導致質(zhì)量平衡法與實際值偏離較大。因此在獸用中藥化學對照品定值中,常使用國家標準物質(zhì)作為溯源物,采用外標法定量佐證。近年來,有研究人員采用差示掃描量熱法(DSC法)驗證對照品純度,即在程序控溫下,測量輸給物質(zhì)與參比物的功率差與溫度,基于熱動力學原理度量總雜質(zhì)絕對含量定值對照品[11]。核磁共振(NMR)技術(shù)作為重要的有機化合物結(jié)構(gòu)解析工具,不僅可以準確獲取化合物結(jié)構(gòu)信息,還能依靠信號峰面積與產(chǎn)生信號的質(zhì)子數(shù)成正比的特性用于定量分析,已收載于《中華人民共和國藥典》2020年版[12]。有研究人員利用氫核磁共振定量(1H-quantative nuclear magnetic resonance,1H-qNMR)技術(shù),采用內(nèi)標法應用于化學對照品輔助定值[13]。

下一步,獸用中藥對照品當根據(jù)實際使用需求不斷擴大品類覆蓋面,更好服務獸藥行業(yè)發(fā)展。綜合現(xiàn)狀,應持續(xù)做好以下三方面工作。一是進行化學成分及藥效物質(zhì)基礎研究。選取真正有效的活性成分為質(zhì)量控制關(guān)鍵成分來研制對照品,以質(zhì)量保障藥效。二是提升分析方法與技術(shù)手段。關(guān)注影響定值的關(guān)鍵因素并進行充分評估,為質(zhì)量平衡法定值提出有效的技術(shù)要求。嘗試研究應用定量核磁共振等新技術(shù),盡可能采用原理不同的定值方法相互佐證,確保結(jié)果準確。三是利用好協(xié)作標定這一賦值重要手段,可對協(xié)作標定的組數(shù)、每組測定的次數(shù)、結(jié)果誤差進行統(tǒng)計學分析,制定更加科學規(guī)范的對照品研制辦法。