細粒棘球絳蟲原頭蚴、包囊壁和成蟲circRNA差異表達分析

王正榮,馬 勛,張艷艷,孫 艷,孟季蒙,薄新文,*

(1.省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室,石河子 832000;2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所,石河子 832000;3.石河子大學動物科技學院,石河子 832000)

細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus,E.granulosus)屬于扁形動物門,絳蟲綱,圓葉目,帶科,棘球屬物種,是囊型包蟲病的主要病原[1]。該病呈世界性分布,我國是囊型包蟲病的高發國家之一。全國20多個省份均有該病發生,主要流行于青海、西藏、新疆、四川等畜牧業較發達的地區。據估計,我國包蟲病患者人數約為100萬,受威脅人口近6 600萬。與現有的全球包蟲病流行數據相比,中國包蟲病受威脅人口數和患者人數仍居世界首位[1-2]。該病已嚴重威脅到廣大農牧區群眾的生命健康和財產安全,是導致我國西部農牧區群眾因病致貧、因病返貧的主要病因之一。該病已被納入“健康中國2030”規劃中的五大寄生蟲病,同時也是我國免費救治的重大傳染病之一[3]。

細粒棘球絳蟲的成蟲寄生于犬科動物的小腸,成熟的蟲卵和孕卵節片隨糞便排出體外,污染草場和水源,被中間宿主牛、羊、駱駝等誤食,蟲卵在胃腸液的刺激下發育為六鉤蚴,六鉤蚴鉆過腸壁,隨血液循環到達宿主全身各處,形成包囊,里面含有大量原頭蚴,其中主要以肝包囊為主。如宿主體內的包囊因機械損傷而破裂,每個原頭蚴又可以發育為新的包囊。終末宿主犬科動物因采食被感染的含有包囊的動物臟器而感染,包囊中的原頭蚴在終末宿主小腸內經大約45 d發育為成熟的蟲體。其中,細粒棘球絳蟲的原頭蚴是蟲體生長發育的主要階段,在中間宿主體內可以經無性生殖發育為新的包囊,在終末宿主體內可以經過有性生殖發育為成蟲,進而產生具有感染性的蟲卵。同時原頭蚴也是細粒棘球絳蟲感染宿主的主要階段,既可以在中間宿主造成二次感染形成新的包囊,也可以感染終末宿主,發育為成蟲,進而形成新的循環[4-5]。由此可見,原頭蚴無論是在蟲體的生長發育,還是感染過程中都發揮著重要作用。但目前對其發育調控機制還知之甚少。近年的研究發現,circRNA是一種重要的非編碼RNA調控分子。該分子呈封閉環狀結構,可通過結合miRNA,作為翻譯模板,調控基因轉錄,與RNA結合蛋白作用等,在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平上等多種水平調控基因表達[6-7]。目前,有關circRNA分子在細粒棘球絳蟲生長發育過程中的生物學功能的研究鮮有報道。基于此,本研究擬采用RNA-seq技術對細粒棘球絳蟲原頭蚴,成蟲以及包囊壁中circRNA表達譜特性進行系統解析,篩選各階段高表達以及特異表達circRNA分子,對其生物學功能進行預測,進而為進一步研究其在蟲體生長發育中的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑及主要儀器

在石河子牛羊屠宰場收集被細粒棘球絳蟲感染的帶有包囊的羊肝3個,4 ℃保溫箱帶回實驗室,無菌條件下抽取含有原頭蚴的包囊液,3 000 r·min-1離心5 min收集原頭蚴,分離包囊壁,用加有1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的PBS洗滌3～5次,最后將收集的原頭蚴、包囊壁保存至-80 ℃冰柜備用。細粒棘球絳蟲成蟲全蟲樣品為本實驗室前期-80 ℃冰柜保存樣品,采自人工感染犬。細粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲的分子鑒定按照參考文獻[8]的方法進行。

胎牛血清購自公司Gibco公司(美國);RPMI 1640細胞培養液購自Sigma公司(美國);小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7購自ATCC細胞庫(中國);SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing試劑盒購自Clontech公司(美國);AMPure XP beads試劑盒購自Beckman公司(美國);Invitrogen TRIzol Reagent購自Invitrogen公司(美國);CW2582 cDNA合成試劑盒購自康為世紀生物技術有限公司(中國);SYBR PremixExTaqMix購自TaKaRa公司(日本);實時熒光定量PCR儀Lightcycle 2.0購自羅氏公司(德國)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及質控 準備足量樣品,按照TRIzol試劑盒提取樣品總RNA,提取后使用微量核酸蛋白測定儀(scandrop100)檢測OD260 nm/OD280 nm值以鑒定RNA樣品濃度,排除RNA污染可能性。Bioanalyzer 2100(Agilent,Santa Clara,CA)用于評估總RNA質量,以RIN≥7且260/280≥1.8為閾值,RNase-free DNase I (Ambion Inc.,Texas,USA)用于消除潛在的基因組DNA污染。分離的RNA樣本保存在-80 ℃環境下。

1.2.2 cDNA文庫構建和RNA測序 RNA質檢合格后,分別從3個發育階段樣品中各取出約10 μg RNA,分別構建測序文庫,主要包括酶促RNA片段化、cDNA合成、測序接頭銜接及PCR擴增等過程。首先,根據EpicentreRibo-Zero Gold 試劑盒(Illumina,San Diego,USA)的操作說明,消耗樣品中的核糖體RNA、線性RNA并純化后,在高溫下使其片段化,隨后轉錄成cDNA文庫,最后分別利用 Illumina Hiseq 4000進行測序。

1.2.3 數據處理及轉錄水平分析 采用Cutadapt軟件對測序產生的原始數據進行過濾[9],除去低質量、含N的序列后,通過Bowtie2軟件[10]和Tophat2軟件[11]將clean reads比對到細粒棘球絳蟲的基因組(GenBank登錄號NW_020170381.1)。通過StringTie[12]軟件識別新的轉錄本,并在此基礎上采用Ballgown[13]軟件估計轉錄物的表達水平。進行基因表達定量前,先通過FPKM算法消除偏好性。在本研究中,采用edgeR軟件包確定差異表達基因[14],同時使用上四分位數算法校正數據,即設定|log2(兩個樣本的 FPKM 比率)|≥1且P≤0.05為閾值。采用TopHat-fusion[15]和CIRCExplorer2[16]軟件對未映射序列進行識別,進而通過反向剪接讀數來估計circRNA的表達水平[17],通過Pearson相關系數R2值估算確定circRNA及其相應親本基因的共表達關系。本研究采用TMeV軟件對差異表達的circRNA進行熱圖繪制,直觀展示各樣本的表達一般規律、差別及變化,從而通過聚類預測新型circRNA的功能及作用。circRNA-miRNA互作分析主要采用Targetscan與miRanda軟件進行靶標預測后取交集,將得到的數據上傳至Cytoscape繪制可視化互作網絡圖。

1.2.4 差異表達circRNA的GO及KEGG通路富集分析 經定量確定的差異表達circRNA仍需深入了解其生物學功能進而發掘重要的調控因子,在生物信息學分析中,常采用基因本體論(gene ontology,GO)進行分析[18]。在GO體系中,可以依次從細胞成分、生物學過程和分子功能3個方面定位基因功能,使用其注釋富集功能將具有相似注釋的轉錄物整合歸類。在預測各類未知circRNA時,除了通過circRNA的宿主基因進行功能預測外,后期還可間接通過它們在生物信號通路中的參與情況進行功能分析。生物通路富集分析主要依賴于京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數據庫[19],其中途徑富集分析可以精確定位差異表達基因的主要代謝轉導和信號傳導途徑。本研究使用Scripts in house軟件進行GO(http:∥geneontology.org)和KEGG(http:∥www.kegg.jp/kegg)富集分析,設置統計P≤0.05為結果顯著閾值。

1.2.5 實時熒光定量PCR驗證 為確保測序結果的準確性和有效性,需要通過qRT-PCR驗證基因表達水平。經過組間對比和篩選,最終選擇4個circRNAs分子進行驗證。根據轉錄本數據庫設計轉錄物引物(表1),使用羅氏實時熒光定量PCR儀Lightcycle 2.0進行定量PCR。試驗結果用采用2-ΔΔ Ct法計算各個基因的相對表達量[20],利用SPSS 22.0軟件對所得表達量進行單因素方差分析(One-way ANOVA),結果分為差異顯著(P≤0.05)和差異極顯著(P≤0.01)。

表1 實時定量PCR試驗相關引物

2 結 果

2.1 RNA-seq 數據分析

采用RNA-Seq和Small RNA-Seq深度測序,成蟲每個樣本文庫內獲得約90 000 000的原始數據,質量控制后平均得到約90 000 000的有效讀段;包囊壁每個樣本文庫內獲得約92 000 000的原始數據,質量控制后平均得到約90 000 000的有效讀段;原頭蚴每個樣本文庫內獲得約86 000 000的原始數據,質量控制后平均得到約86 000 000的有效讀段。Q-score>20的reads在99%以上,Q-score>30的reads在97%。綜上,充分證明樣本數據處理得當,質量可靠,符合下游數據分析要求。在深度分析樣本注釋結果,評估細粒棘球絳蟲不同發育階段中轉錄本豐度及表達差異情況前,計算評估了各生物學重復間皮爾森積矩相關系數平方(R2)均大于0.98,均滿足統計學要求。

經篩選鑒定,最終鑒定得到635個circRNAs分子,其中有573個屬于外顯子來源的circRNAs分子,有14個屬于內含子來源的circRNAs分子,有48個屬于外顯子-內含子circRNAs分子。對獲得的circRNA分子的堿基組成分析發現,來源于成蟲的circRNA分子,其GC為58.88%,來源于包囊壁的circRNA分子,其GC為60.09%,而來源于原頭蚴的circRNA分子,其GC為59.74%。對circRNA分子的長度分析發現,成蟲的crcRNA分子,其平均長度為2 100 nt左右,最長為17 013 nt,最小為191 nt;原頭蚴的circRNA分子,其平均長度為1 560 nt左右,最長為20 176 nt,最小為179 nt;包囊壁的其平均長度為1 580 nt左右,最長為20 176 nt,最小為179 nt。

2.2 差異表達circRNA的鑒定

在細粒棘球絳蟲的3個不同發育階段,共鑒定635個circRNAs分子,利用FPKM算法標準化基因轉錄水平差異,以細粒棘球絳蟲原頭蚴為參照,和成蟲相比,有74個差異表達的circRNAs分子,其中上調表達的有68個,下調表達的有6個(圖1a);和包囊壁相比,有64個差異表達的circRNAs分子,其中上調表達的有55個,下調表達的有9個(圖1b);成蟲和包囊壁相比,有45個差異表達的circ-RNAs分子,其中上調表達有1個,下調表達的有44個(圖1c);圖1 d顯示了circRNA分子在細粒棘球絳蟲原頭蚴、包囊壁和成蟲差異表達的熱圖分析結果。其中在原頭蚴階段特異表達的circRNA有44個,包括novel_circ_0000037、novel_circ_0000254、novel_circ_0000307、novel_circ_0000379、novel_circ_0000501、novel_circ_0000537、novel_circ_0000704、novel_circ_0000855、novel_circ_0001062、novel_circ_0001105、novel_circ_0001221、novel_circ_0001250、novel_circ_0001375、novel_circ_0001424、novel_circ_0001490、novel_circ_0001554、novel_circ_0001585、novel_circ_0001781、novel_circ_0001932、novel_circ_0002021、novel_circ_0002060、novel_circ_0002101、novel_circ_0002298、novel_circ_0002332、novel_circ_0002371、novel_circ_0002391、novel_circ_0002416、novel_circ_0002509、novel_circ_0002635、novel_circ_0002713、novel_circ_0002843、novel_circ_0002909、novel_circ_0003207、novel_circ_0003410、novel_circ_0003417、novel_circ_0003436、novel_circ_0003558、novel_circ_0003815、novel_circ_0003867、novel_circ_0003978、novel_circ_0003986、novel_circ_0004074、novel_circ_0004131和novel_circ_0004185;包囊壁特異表達的circRNA分子有2個,為novel_circ_0002919和novel_circ_0003163;成蟲階段未發現特異表達的circRNA分子。

以原頭蚴為參照,分別和包囊壁以及成蟲相比,其特異性差異表達的circRNA分子數量分別為58和68個,共同差異表達的circRNAs分子為6個,分別為novel_circ_0000017、novel_circ_0000654、novel_circ_0002024、novel_circ_0002781、novel_circ_0003640和novel_circ_0004249(圖2a)。以包囊壁為參照,分別和原頭蚴以及成蟲相比,其特異性差異表達的circRNA分子分別為60和41個,共同差異表達的circRNA分子為4個,分別為novel_circ_0002781、novel_circ_0003060、novel_circ_0003061和novel_circ_00032370(圖2b)。

進一步的分析發現,在細粒棘球絳蟲原頭蚴階段高表達top10的circRNA分子包括novel_circ_0003572、novel_circ_0003080、novel_circ_0002505、novel_circ_0003345、novel_circ_0002695、novel_circ_0000126、novel_circ_0004249、novel_circ_0003763、novel_circ_0001419和novel_circ_0004199。在成蟲階段高表達top10的circRNA分子包括novel_circ_0003572、novel_circ_0001343、novel_circ_0003080、novel_circ_0002505、novel_circ_0003345、novel_circ_0001341、novel_circ_0000582、novel_circ_0002695、novel_circ_0000126和novel_circ_0002031。在原頭蚴和成蟲兩個階段均高表達的circRNA分子包括novel_circ_0003572、novel_circ_0003080、novel_circ_0002505、novel_circ_0003345和novel_circ_0002695。在包囊壁階段高表達top10的circRNA分子包括novel_circ_0000654、novel_circ_0002781、novel_circ_0003237、novel_circ_0003060、novel_circ_0003061、novel_circ_0004249、novel_circ_0002463、novel_circ_0002024、novel_circ_0003163和novel_circ_0002278。

2.3 差異表達circRNA的GO分析

GO分析結果顯示,原頭蚴和成蟲相比,差異表達的CircRNA的顯著富集于75個條目,包括14個分子功能條目,22個細胞組分條目,39個生物學過程條目。主要富集于分子功能的核苷酸酶活性、腺苷酰轉移酶活性、水解酶活性和FDA結合等;細胞組分的細胞內、細胞以及細胞部分等;生物學過程的多細胞生物的生殖、單細胞生物的生殖、氰酸酯代謝、有性生殖、精子發生、雄性配子產生、軸系發生以及神經生成、分化等(圖3)。原頭蚴成包囊壁相比,差異表達的circRNA的顯著富集于55個條目,包括34個生物學過程條目,12個細胞組分條目,9個分子功能條目。主要富集于生物學過程的脂質定位、氰酸酯代謝過程、調節脂質沉積以及細胞壁大分子分解代謝過程等;細胞組分的固有的細胞器膜、細胞器膜組成部分、固有的高爾基膜以及高爾基膜組成部分等。分子功能的酰輔酶A脫氫酶活性、溶菌酶活性、ADP結合以及結構分子活性等(圖4)。成蟲和包囊壁相比,差異表達的差異表達的CircRNA的顯著富集于65個條目,包括18個分子功能條目,14個細胞組分條目,33個生物學過程條目。主要富集于分子功能的FDA結合、二甲基丙酸錫脫硫甲基酶活性和6-磷酸果糖激酶活性等;細胞組分的病毒膜、細胞前緣及細胞色素b6f蛋白復合體等;生物學過程的磷酸烯醇式丙酮酸依賴性糖磷酸轉移酶系統、碳水化合物運輸、精子發生、雄性配子產生、軸系發生以及神經生成、分化等(圖5)。

圖3 細粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲差異表達circRNA分子的GO功能分析

圖4 細粒棘球絳蟲原頭蚴和包囊壁差異表達circRNA分子的GO功能分析

2.4 差異表達circRNA的KEGG分析

KEGG分析結果顯示,原頭蚴和包囊壁相比,差異表達的circRNA的顯著富集于背腹軸形成、Notch、wnt以及FoxO信號通路等(圖6a)。原頭蚴和成蟲相比,差異表達的circRNA的顯著富集于Notch、三羧酸循環、磷脂酰肌醇、核黃素代謝通路以及脂肪酸合成和降解等信號通路。成蟲和包囊壁相比,差異表達的circRNA的顯著富集于Notch、碳代謝、三羧酸循環以及糖酵解/糖異生通路。圖6b顯示了差異表達的circRNA在Notch信號通路的富集情況,圖6c顯示了circRNA在背腹軸形成信號通路的富集結果。

a.原頭蚴和包囊壁中差異表達circRNA的KEGG信號通路顯著富集結果;b.差異表達circRNA在NOTCH信號通路的富集結果;c.差異表達circRNA在DORSO-VENTRAL AXIS FORMATION(Grk/Egfr)信號通路的富集結果

2.5 circRNA-miRNA-mRNA 共表達調控網絡

將篩選得到的差異表達circRNA及其靶向的miRNA和mRNA進行轉錄調控分析和共表達網絡分析。原頭蚴和成蟲相比,有33個差異表達的circRNAs與24個miRNAs以及108個mRNAs構成302個circRNA-miRNA-mRNA調控網絡。其中24個差異表達circRNAs和其互作的14個miRNAs、55個mRNAs形成164個調控網絡符合circRNA上調表達,miRNA下調表達,mRNA下調表達的規律(圖7)。原頭蚴和包囊壁相比,有2個差異表達的circRNAs與1個miRNA以及1個mRNA構成2個circRNA-miRNA-mRNA調控網絡。成蟲和包囊壁相比,有16個差異表達的circRNAs與10個miRNAs以及37個mRNAs構成73個circRNA-miRNA-mRNA調控網絡。其中有13個差異表達的circRNAs與7個miRNAs以及16個mRNAs構成36個下調-上調-下調的circRNA-miRNA-mRNA調控網絡(圖8)。

圖7 細粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲差異表達circRNA分子上調-下調-上調型circRNA-miRNA-mRNA的調控通路分析

圖8 細粒棘球絳蟲成蟲和包囊壁差異表達circRNA分子下調-上調-下調型circRNA-miRNA-mRNA的調控通路分析

2.6 實時熒光定量檢測

為驗證從轉錄組測序數據中獲得差異基因結果的可靠性,隨機選取4個差異表達的circRNAs進行qRT-PCR驗證,其中包括novel_circ_0003572、novel_circ_0002024、novel_circ_0003223和novel_circ_0003080,結果顯示qRT-PCR驗證結果與RNA-seq測序結果一致,進一步說明轉錄組測序結果可信(圖9)。

圖9 差異表達circRNA的qRT-PCR驗證分析

3 討 論

環狀RNA(CircRNAs)是一類不具有5′端帽子和3′端ploy(A)尾巴結構的共價閉合環狀RNA分子[21-22]。早在1976年,Sanger等[23]就在植物類病毒中發現了CircRNA。隨后的幾十年間,科學家又相繼在小鼠、猴、豬、人等物種中發現了circRNA[24-27]。由于傳統的分子生物學方法對circRNA數量和豐度的檢測能效都非常有限,因此一直以來circRNA被認為是RNA異常剪接的產物。近年來隨著生物信息學的快速發展和高通量測序技術的不斷革新,目前已經在真核細胞中發現了大量內源circRNAs,大部分circRNA結構穩定,豐度高且呈現出時空表達特異性,說明circRNA可能在調控基因表達過程中發揮著重要作用[21,28]。根據序列構成的差異可以將circRNA分為3類:外顯子circRNA (exonic circRNA,ecRNA),內含子circRNA(circular intronic RNA,ciRNA),外顯子-內含子circRNA (exon-intron circRNA,Elci-RNA)[29-31]。這些circRNA具有自身特有的產生方式,同時它們的生物學功能也有一定差異。與其他非編碼RNA一樣,circRNA的序列和結構決定了它的生物學功能。circRNA可能通過以下幾種方式發揮生物學功能:miRNA海綿,作為翻譯模板,調控基因轉錄,與RNA結合蛋白作用[32-34]。

目前有關寄生蟲circRNA的研究報道相對較少。Broadbent 等[35]研究發現瘧原蟲有數百個circRNA分子,并對其中部分分子進行了初步驗證。Zhou 等[36]測序分析發現circRNA分子在捻轉血矛線蟲3期幼蟲、成熟雌蟲和雄蟲中存在差異表達,且其功能主要與機體代謝、MAPK信號通路以及磷脂酰肌醇信號通路相關。同時也有部分學者對宿主應對寄生蟲感染時宿主circRNA分子的差異表達進行了研究,挖掘出一些與宿主應對寄生蟲感染相關的circRNA分子[37-39]。近年來,也有棘球絳蟲circRNA相關的研究報道,但多數研究者把研究的焦點放在宿主方面,如Kalifu 等[40]研究發現,和正常肝組織相比,患者包囊組織中有177個ccircRNAs分子的表達出現上調,166個出現下調。基因功能聚類分析發現這些差異表達的circRNA分子可能參與有機化合物循環、內源性刺激以及細胞生物過程等。之后,Liu等[41]研究發現,在多房棘球絳蟲感染的小鼠肝細胞、肝星狀細胞和肝枯否細胞中共鑒定到6 290個circRNAs分子,進一步的分析發現在多房棘球絳蟲感染后2和3個月的時候,小鼠肝細胞、肝星狀細胞和肝枯否細胞中分別有834個、834個以及760個差異表達的circRNA分子。目前,僅有1篇有關細粒棘球絳蟲蟲體本身circRNA相關的研究報道,此研究發現在細粒棘球絳蟲原頭蚴與包囊液外泌體中分別有1 277和512個circRNAs分子,其中有183個circRNAs分子是二者共有的[42]。由以上研究可以發現,目前對棘球絳蟲circRNA的研究,基本還是停留在組學測序分析階段,有關其具體生物學功能的研究還未見報道。同時,有關系統解析細粒棘球絳蟲不同發育階段,即原頭蚴,成蟲以及包囊壁相關circRNA的研究亦未見報道。基于此,為了揭示circRNA分子在細粒棘球絳蟲不同發育階段的差異表達以及發生的分子事件,本研究采用RNA-seq技術系統解析了circRNA分子在細粒棘球絳蟲原頭蚴,成蟲以及包囊壁中的表達譜特性,篩選了各階段高表達以及特異表達circRNA分子,并對其生物學功能進行了預測,為進一步揭示這些差異表達的circRNA分子在蟲體生長發育中的調控機制提供了理論依據。

本研究的結果顯示,circRNA在細粒棘球絳蟲原頭蚴、包囊壁和成蟲的表達均存在差異。同時,本研究首次在細粒棘球絳蟲原頭蚴和包囊壁中分別鑒定到44和2個特異表達的circRNA分子,推測其在蟲體原頭蚴和包囊壁的發育過程中可能發揮重要作用。對差異表達circRNA分子的GO分析結果顯示,當成蟲和原頭蚴、包囊壁相比,部分差異表達的circRNA分子的功能顯著富集于有性生殖、精子發生、雄性配子產生、軸系發生以及神經生成、分化等過程。這一結果和細粒棘球絳蟲發育規律恰好吻合,相對于蟲體原頭蚴和包囊壁,成蟲是蟲體有性生殖、精子發生和雄性配子產生的主要階段,也是蟲體前后軸發育,神經生成、分化的主要階段[43],此結果提示這些差異表達的circRNA分子可能參與調控了細粒棘球絳蟲以上的生物學過程。對差異表達circRNA分子的KEGG分析結果顯示,原頭蚴和包囊壁相比,差異表達的circRNA顯著富集于背腹軸形成和Notch信號通路。

本研究對差異表達circRNA進行ceRNA調控網絡分析發現,有164個ircRNA-miRNA-mRNA調控通路屬于up-down-up的調控形式,有36個circRNA-miRNA-mRNA調控通路屬于down-up-down的調控形式。同時,分析發現有8個編碼基因既參與up-down-up調控通路,又參與down-up-down調控通路,包括thymidine kinase、ccaat enhancer binding protein beta、caspase 8、THUMP domain containing protein 1、ETS transcription factor Elf 2、SH2、tetraspanin和Heat shock 70 kDa protein 4。其中ccaat enhancer binding protein beta是一種神經發育相關調控蛋白,已有研究顯示此蛋白在成年嚙齒動物大腦的不同部位表達[44-45]。在突觸可塑性和記憶形成中發揮重要作用,尤其是在海馬體[46-47]、神經元分化[48-49]和海馬神經原的發育中發揮重要調控作用[50],與其互作的miRNA為egr-miR-10227a-5p,circRNA為novel_circ_0000152。而SH2是一種精子發育相關調控基因,具體參與調控精子核的形狀[51],與其互作的miRNA為novel_19,circRNA分別為novel_circ_0002024、novel_circ_0003572、novel_circ_0003223和novel_circ_0001419。

在up-down-up的調控通路中,還有1個參與調控雄性生殖細胞生長發育相關的基因,即Tesmin TSO1 CXC,此基因在雄性配子的發育以及精子的分化過程中起到調控作用[52],與其互作的miRNA為egr-miR-4990,circRNA分別為novel_circ_0002152、novel_circ_0000017、novel_circ_0002024、novel_circ_0000654、novel_circ_0000253和novel_circ_0003999。Tetraspanin是一類四跨膜蛋白,此家族成員在絳蟲基因組中發生擴張[53],并且可能是宿主/病原體微界面的主要成分,同時也是絳蟲釋放到宿主體內外泌體的主要組成部分[54],此類蛋白可以結合宿主抗體的Fc區域[55],并且其本身具有很高的免疫原性[56],與其互作的miRNA為novel_19,circRNA為novel_circ_0002024、novel_circ_0003572、novel_circ_0003223和novel_circ_0001419。對結果的分析發現,novel_circ_0003572既在蟲體原頭蚴和成蟲階段高表達,又可能參與調控蟲體雄性生殖系統的發育以及蟲體的免疫調控等過程,提示其可能具有重要的生物學功能,可以作為后續深入研究的一個靶標。除此之外,還發現novel_circ_0002024、novel_circ_0003223和novel_circ_0001419同樣也參與調控多個生物學過程,提示這些分子也可能在細粒棘球絳蟲的生長發育過程中發揮重要功能,但其具體的生物學功能還有待進一步研究。

4 結 論

綜上所述,本研究首次系統解析了circRNA在細粒棘球絳蟲原頭蚴、包囊壁以及成蟲的差異表達譜特性。篩選了細粒棘球絳蟲各發育階段高表達以及特異表達的circRNA分子,并且初步預測了蟲體精子生長發育以及蟲體神經生成、分化相關的circRNA分子及其circRNA-miRNA-mRNA調控通路,為進一步闡明circRNA分子在細粒棘球絳蟲生長發育中的作用提供了新的視角。