虎地腸溶膠囊對放射性腸炎的防護(hù)作用及其機(jī)制

馬洪林,周夢麗,饒先玥,汪 浩,張明霞

放射性腸炎是盆腔腫瘤放射治療中嚴(yán)重并發(fā)癥之一,常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、腸出血、腸梗阻等,嚴(yán)重時可出現(xiàn)腸穿孔危及生命[1]。一旦出現(xiàn)上述嚴(yán)重并發(fā)癥,會導(dǎo)致放療的中止,嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后。目前臨床缺乏有效的防治藥物,但一些中藥制劑表現(xiàn)一定療效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為放射線屬“火熱毒邪”,放療后邪毒侵襲致脾胃功能受損,水濕內(nèi)生,腸道功能傳導(dǎo)失常謂之泄瀉[2]。石文君 等[3]研究表明放射治療會引起火毒之邪,致脾胃功能減退,體內(nèi)濕氣增加,正氣內(nèi)虛加劇,外邪更旺,是以正氣內(nèi)虛為本,火毒侵襲為標(biāo)。中醫(yī)治療主要為清熱利濕,活血化瘀?；⒌啬c溶膠囊具有清熱、利濕作用,可用于治療非特異性潰瘍性結(jié)腸炎等[4]。有研究[5]表明虎地腸溶膠囊在宮頸癌放療中使用可延緩放射性腸炎的發(fā)生,但具體機(jī)制不明。此次實驗以大鼠小腸隱窩細(xì)胞(IEC-6細(xì)胞)為研究對象,探討虎地腸溶膠囊放射性腸炎防治方面的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠IEC-6細(xì)胞購自上海富衡生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗溶液購自美國Hyclone公司;澳洲胎牛血清購自美國 Gibco 公司;虎地腸溶膠囊購自安徽九方制藥有限公司(產(chǎn)品批號:190404);Anti-P21、Anti-P16購自英國Abcam公司;β-actin、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2, SOD2)、過氧化氫酶(catalase,CAT)抗體購自上海信裕生物工程有限公司;β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海晅科生物科技有限公司。

1.2 IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞用含有1%青鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37.0 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,觀察細(xì)胞密度至90%以上即可傳代,選對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗?；⒌啬c溶膠囊粉劑加入95%乙醇超聲提取,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提純藥物后于真空泵中抽干,提取物溶于二甲基亞砜。因提取物為復(fù)方制劑,濃度計算方式為質(zhì)量/體積。細(xì)胞分6組:對照組,未接受輻射及藥物;模型組,僅接受最佳照射劑量輻射;虎地腸溶提取液組,將最佳濃度的提取液在照射前2 h加入培養(yǎng)基;照射劑量組,單純接受不同劑量的電離輻射;提取液濃度A組,單純將不同濃度提取液加入細(xì)胞培養(yǎng)基,不接受輻射;提取液濃度B組,將不同濃度的提取液在照射前2 h加入培養(yǎng)基。將12.5、25、50、100、200 μg/ml濃度的提取液在照射前2 h加入培養(yǎng)基,測量在各濃度下細(xì)胞活力。篩選出安全濃度范圍后,在(10、20、40、80 μg/ml)虎地腸溶提取液濃度下電離輻射后的細(xì)胞活力,選取最佳藥物濃度。

1.3 細(xì)胞克隆形成實驗對照組和照射劑量組細(xì)胞,消化并稀釋至110 個/ml時,接種于6孔板內(nèi),每孔600個細(xì)胞,置于5%CO2、37.0 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周,當(dāng)細(xì)胞集落出現(xiàn)時,加入純甲醇固定15 min,去除固定液,加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min,洗去染色液,在顯微鏡下統(tǒng)計細(xì)胞克隆數(shù)。

1.4 細(xì)胞活力檢測細(xì)胞懸液按4 000個/孔細(xì)胞數(shù)接種在96孔板上,細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的虎地腸溶提取液培養(yǎng)24 h。每孔加10 μl CCK-8溶液,放入培養(yǎng)箱內(nèi)1 h,450 nm波長處測吸光度。

1.5 ROS檢測對照組、模型組及虎地腸溶提取液組細(xì)胞照射后6 h檢測ROS。將DCFH-DA按1 ∶1 000 比例配到無血清培養(yǎng)基中,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、離心,加入DCFH-DA每組1 ml,放入培養(yǎng)箱內(nèi)25 min,無血清DMEM培養(yǎng)基和PBS洗滌,使用熒光顯微鏡觀察。

1.6 細(xì)胞衰老檢測6孔板內(nèi)各組細(xì)胞輻射后48 h進(jìn)行細(xì)胞衰老檢測。去除培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,加入1 ml β-Gal染色固定液,室溫固定10 min,吸去固定液,PBS洗滌3次。吸除PBS,加1 ml染色工作液。37 ℃孵育過夜,需在無二氧化碳環(huán)境下孵育。普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測輻射后24 h收集細(xì)胞,常規(guī)消化處理,取1×105～5×105消化后的細(xì)胞混懸液離心,4 ℃預(yù)冷PBS洗滌1次,離心棄上清液后,加入100 μl緩沖液(稀釋的1×Binding Buffer)重懸細(xì)胞,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI并混勻。避光25 ℃下孵育15 min,再加400 μl緩沖液上機(jī)檢測。

1.8 Western blot法測定蛋白表達(dá)將照射后24 h的各組細(xì)胞,冰上裂解并提取總蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗稀釋液搖床4 ℃過夜。TBST洗膜,加入二抗稀釋液室溫?fù)u床1 h,TBST洗膜后通過ECL反應(yīng),膠片曝光成像,Quantity One 軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 輻射對細(xì)胞增殖的影響在4～10 Gy劑量輻射后細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)低于對照組(P<0.001),隨著輻射劑量增加,克隆團(tuán)數(shù)量減少(P<0.001),見表1和圖1。

圖1 對照組及照射劑量組電離輻射后細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)量 ×200A:對照組;B～F:輻射劑量為2、4、6、8、10 Gy;與對照組比較:***P<0.001

表1 電離輻射對細(xì)胞增殖的影響

2.2 虎地腸溶提取液對細(xì)胞活力影響CCK-8法進(jìn)行吸光度值檢測,虎地腸溶組濃度為100、200 μg/ml時與對照組比較細(xì)胞吸光度值及存活率下降(P<0.001),其余濃度下與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見表2和圖2。

圖2 虎地腸溶提取液對細(xì)胞活力影響A:對照組;B～F:提取液濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/ml;與對照組比較:***P<0.001

表2 虎地腸溶提取液對細(xì)胞活力影響

2.3 虎地腸溶提取液對輻射后細(xì)胞的活力影響模型組和10、20 μg/ml濃度的虎地腸溶提取液組細(xì)胞吸光度值及存活率低于對照組(P<0.001)。而40、80 μg/ml的虎地腸溶組細(xì)胞吸光度值及存活率高于模型組(P<0.001),見表3和圖3。

表3 虎地腸溶提取液對輻射后細(xì)胞的活力影響

2.4 各組之間DCFH-DA熒光強(qiáng)度、β-Gal陽性率及細(xì)胞凋亡率比較與對照組相比,模型組的DCFH-DA熒光強(qiáng)度、β-Gal陽性率及細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),與模型組比較,虎地腸溶提取液組DCFH-DA熒光強(qiáng)度、β-Gal陽性率及細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05),見圖4～6。

圖4 3組IEC-6細(xì)胞內(nèi)ROS變化 ×200A:對照組;B:模型組;C:虎地腸溶提取液組

圖5 3 組IEC-6細(xì)胞β-Gal染色結(jié)果 ×200A:對照組;B:模型組;C:虎地腸溶提取液組;β-Gal陽性染色呈青綠色

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡水平A:對照組;B:模型組;C:虎地腸溶提取液組

2.5 虎地腸溶提取液的干預(yù)對P16、P21、CAT、SOD2表達(dá)影響與模型組比較,虎地腸溶組和對照組細(xì)胞SOD2、CAT的蛋白表達(dá)升高(P<0.05),P16、P21蛋白的表達(dá)降低(P<0.05),見圖7。

圖7 Western blot 檢測各蛋白表達(dá)情況A:Western blot檢測各組目的蛋白的表達(dá);B:SOD2蛋白相對表達(dá)量;C:CAT蛋白相對表達(dá)量; D:P16蛋白相對表達(dá)量; E:P21蛋白相對表達(dá)量;a:對照組; b:模型組;c:虎地腸溶提取液組;與對照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05

3 討論

急性放射性腸炎的發(fā)生主要是腸黏膜上具有快速增殖特性的隱窩上皮細(xì)胞有絲分裂受到抑制,腸道黏膜的更新能力喪失,導(dǎo)致細(xì)胞的衰老、凋亡的發(fā)生[6]。腸上皮細(xì)胞的更新主要是隱窩中的腸干細(xì)胞維持,隱窩上皮細(xì)胞在放射性腸損傷中占重要地位,IEC-6細(xì)胞分離自大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞,能更好地模擬放射性腸炎的特性。結(jié)合輻射后的細(xì)胞存活率,考慮細(xì)胞數(shù)目過少可能影響實驗結(jié)果,選擇6 Gy作為輻射劑量。

電離輻射可以促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激,通過影響脂質(zhì)、膜、蛋白質(zhì)和DNA導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞變化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并引發(fā)炎癥反應(yīng)[7-9]。DCFH-DA熒光探針可以檢測出細(xì)胞內(nèi)ROS水平,實驗顯示虎地腸溶提取液可以抑制輻射引起的ROS水平升高。這種抑制作用是否與抗氧化能力增加有關(guān),我們可以根據(jù)一些抗氧化指標(biāo)來判斷。SOD2通過清除氧自由基促進(jìn)了抗氧化、抗凋亡等保護(hù)機(jī)制[10]。CAT 也有抗氧化、抗凋亡作用。本實驗Western blot結(jié)果顯示虎地腸溶組SOD2及CAT指標(biāo)較模型組升高,說明虎地腸溶提取液通過提高細(xì)胞抗氧化能力,達(dá)到降低ROS水平及氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。

電離輻射可以直接損傷細(xì)胞DNA,產(chǎn)生大量ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)衰老[11]。衰老細(xì)胞的生理功能和應(yīng)激反應(yīng)下降,對細(xì)胞損傷后的自我修復(fù)能力下降。β-Gal作為一種細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶,被認(rèn)為是衰老細(xì)胞的特異性標(biāo)志物之一[12]。p16和p21是衰老細(xì)胞的特異性基因,其中p21作為p53的下游基因參與衰老調(diào)控,并通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4、CDK6、CDK2調(diào)控細(xì)胞周期[13-14]。研究[15]結(jié)果顯示細(xì)胞經(jīng)電離輻射后β-Gal活性增加,p16、p21基因表達(dá)增加。本研究可以通過上述指標(biāo)觀察細(xì)胞的衰老情況。根據(jù)Western blot檢測蛋白和β-Gal染色結(jié)果,提示虎地腸溶提取液減輕了輻射損傷后的細(xì)胞衰老。

通過本次實驗結(jié)果可以得出結(jié)論,虎地腸溶提取液可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,減少氧化應(yīng)激,來減輕電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老及凋亡。然而電離誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的機(jī)制是復(fù)雜的,作用靶點也是多樣的,既可以通過直接損傷傳到黏膜屏障,也可以調(diào)控細(xì)胞衰老和凋亡的信號通路造成細(xì)胞的損傷。本實驗研究結(jié)果僅得出氧化應(yīng)激與電離輻射損傷相關(guān)性,而氧化應(yīng)激造成細(xì)胞損傷的信號通路仍不明確,對于放射性腸炎的復(fù)雜致病機(jī)制來說有一定局限性,并且虎地腸溶膠囊作為一種復(fù)方中藥制劑,其結(jié)構(gòu)及組成也是復(fù)雜的,在放射性腸炎治療中發(fā)揮主要作用的成分未能明確,因此其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。