短時程光照對小鼠SCN和LHB谷氨酸受體表達的影響

李佳逸,金巧玲,王烈成,程 娟

光對生物節律和情緒的調控是通過自感光神經節細胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cell, ipRGC)對哺乳動物的節律中樞視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)和外側韁核(lateral habenula, LHB)的直接投射[1]。Fernandez et al[1]驗證了短時程光周期可誘發小鼠產生抑郁樣行為。ipRGC在SCN和LHB腦區的神經末梢釋放谷氨酸和垂體腺苷酸環化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)[2],PACAP主要通過與其特異性受體PAC1結合產生作用[3]。抑制SCN內谷氨酸信號,會使得光誘導的節律性相移停止[4],N-甲基-D-天冬氨酸受體亞型2(N-methyl-D-aspartic acid receptor subunit 2,NR2B)是介導光授時信號傳遞的重要組成部分[5]。LHB內興奮性突觸傳遞主要編碼厭惡刺激和情感狀態,這一活動主要由α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPAR)介導[6]。阻斷LHB中的NMDAR可以挽救嚙齒動物抑郁癥模型中的快感缺乏[7]。此外,LHB中PACAP-PAC1信號通路與焦慮和應激障礙的產生有關[8]。該研究將利用免疫印跡(Western blot)的方法,探究短時程光照下,SCN及LHB腦區中谷氨酸信號通路、PACAP-PAC1信號通路及下游關鍵性蛋白的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本實驗使用的動物均為SPF級、C57BL/6J雄性小鼠,6～8周齡,體質量20～25 g,購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司。小鼠被置于T24光暗循環 (12 h/12 h)環境下,適應1～2周后,進行分組,將實驗組小鼠置于T7 (3.5 h/3.5 h) 的光暗循環環境下飼養,對照組小鼠繼續置于T24 (12 h/12 h) 的光環境下飼養,實驗期間自由提供水和食物,4～6周后用于實驗。所有動物實驗操作均符合安徽醫科大學動物倫理委員會的要求。

1.2 主要抗體Mouse anti-GAPDH購自美國Santa公司;HRP Goat anti-Mouse、IgG HRP Goat anti-Rabbit IgG購自江蘇Affinity公司;Rabbit anti-NR2A、Rabbit anti-NR2B、Rabbit anti-P-PKA購自江蘇Affbiotech公司;Mouse anti-PAC1購自上海Absin公司;Mouse anti-GluR1購自美國Novus公司;Rabbit anti-GluR2購自成都正能生物。

1.3 主要儀器垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司;低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司;電子分析天平購自德國Sartorius公司;研磨儀購自武漢塞維爾公司;凝膠成像顯影儀購自上海培清公司; 純水儀購自合肥宏科公司;滾軸搖床購自海門海寧其林貝爾儀器公司; 金屬浴購自杭州米歐公司。

1.4 方法

1.4.1溶液配制 ① 10×三羥甲基氨基甲烷(hydroxymethyl aminomethane, Tris)-甘氨酸緩沖液:精確稱量144 g甘氨酸,30.3 g Tris,定容至1 L,混勻后,室溫保存。② 1×電泳溶液:取100 ml 10×Tris-甘氨酸緩沖液定容至1 L,稱取1 g十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS),混勻后4 ℃儲存。③ 1×轉膜溶液:取100 ml 10×Tris-甘氨酸緩沖液,加入200 ml甲醇,定容至1 L,混勻后4 ℃ 儲存。④ 10×Tris緩沖液:稱取24.2 g Tris加入雙蒸水800 ml,用HCl調pH至7.6后加入80 g NaCl,混勻后,定容至1 L,4 ℃儲存。⑤ 1×吐溫三羥甲基氨基甲烷緩沖液(tris buffered saline with Tween, TBST)溶液:稱取100 ml 10×三羥甲基氨基甲烷緩沖液(tris buffered saline, TBS)定容至1 L,加入1 ml吐溫20,混勻后4 ℃儲存。

1.4.2組織蛋白的提取 授時因子時間(zeitgeber time, ZT)為人為控制的光暗時間,以ZT 0為開燈時間,在24 h內,組織樣品的取樣時間分別是ZT 1、ZT 5、ZT 9、ZT 13、ZT 17、ZT 21,夜間配戴紅外頭燈取樣。取樣在光學顯微鏡下利用眼科手術器械操作,選取年齡體質量相近的小鼠,全程低溫通氧。樣品獲取后分別置于2 ml離心管中,加入200 μl RIPA裂解液(加1%蛋白酶抑制劑)于離心管中,在4 ℃研磨儀內充分研磨。用無菌的鑷子取出離心管中的鋼珠,放入提前預冷的4 ℃ 低溫超速離心機進行離心, 12 000 r/min,4 ℃,15 min。離心后吸取上清液,加入5×蛋白上樣緩沖液,100 ℃、10 min煮樣,分裝后-80 ℃ 保存。

1.4.3配制十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)凝膠 分離膠:5.9 ml ddH2O,5.0 ml 30%聚丙烯酰胺,3.8 ml 1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8),0.15 ml 10%SDS,0.15 ml 10%過硫酸銨,0.006 ml四甲基乙二銨(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, TEMED)。按照10%的配方加入試劑,最后加入200 μl異丙醇,室溫放至凝固。濃縮膠:4.1 ml ddH2O,1.0 30% 聚丙烯酰胺,0.75 ml 1.0 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),0.06 ml 10%SDS,0.06 ml 10%過硫酸銨,0.006 ml TEMED。將異丙醇倒出,按照5%的配方加入試劑,充分混勻后,立刻灌入玻璃板,室溫放至凝固。

1.4.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)設置凝膠電泳參數 恒壓80 V 20 min,切換電壓為恒壓100 V,直至所需目的蛋白充分分離后停止。

1.4.5轉膜與顯色 電泳結束后,將分離膠放入轉膜液中,設置參數為恒流260 mA、120 min。轉膜結束后,封閉2 h。棄去封閉液,加入1 × TBST洗滌3次,1次/1 min。將谷氨酸受體和下游分子受體的一抗按以下的稀釋濃度配制:NMDAR-2A(NMDA receptor 2A, NR2A) (1 ∶500); NMDAR-2B(NMDA receptor 2B, NR2B)(1 ∶500); AMPAR1(AMPA receptor 1, GluR1) (1 ∶1 000);AMPAR2(AMPA receptor 2, GluR2)(1 ∶1 000); anti-PAC1 (1 ∶500); 磷酸化的蛋白激酶A(phosphorylated protein kinase A, P-PKA)(1 ∶1 000); 磷酸化的細胞外調蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases, P-ERK)(1 ∶1 000); Ca2+/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium-CaM-dependent protein kinase II, CaMK II)(1 ∶1 000); 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) (1 ∶1 000), 4 ℃過夜。取出膜,加入1×TBST洗滌3次,1次/10 min。二抗孵育1 h,HRP Goat anti-Mouse IgG/HRP Goat anti-Rabbit IgG (1 ∶10 000)。棄去二抗, 1× TBST充分洗滌,3次/10 min。將膜置于凝膠成像系統中顯影。

2 結果

2.1 短時程光周期影響SCN谷氨酸受體和PAC1受體的表達與T24光周期相比,T7光周期下SCN的PAC1受體變化差異無統計學意義(圖1B);與T24光周期相比,在T7光周期下,GluR1的總體表達呈現低于對照組的趨勢,但差異無統計學意義(圖1D);在ZT 1和ZT 5,與T24光周期相比,T7光周期的GluR2蛋白表達上升(圖1F:t=3.565,P=0.016 1;t=4.064,P=0.009 7),且GluR2的表達均在ZT 13達到峰值;與T24光周期相比,T7光周期下NR2B的表達整體上升(圖1J,P=0.011 5),且T7光周期下和T24光周期下小鼠SCN中NR2B的表達均在ZT 13達到峰值。與T24光周期相比,T7周期下GluR2的總體表達上調(圖1F,P=0.006 7),結果顯示SCN中GluR2和NR2B在T7光周期下表達上升,表明短時程光照可能是通過影響谷氨酸受體的表達從而影響生物節律的穩定。

圖1 T24及T7光周期對SCN的谷氨酸受體和PAC1受體的影響A、C、E、G、I:T7或T24周期下PAC1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2受體蛋白表達的代表圖;1:T24;2:T7;B:SCN中PAC1受體的表達;D、F:SCN中GluR1、GluR2的表達;H、J:SCN中NR2A、NR2B的表達;與T24光周期蛋白整體表達比較:*P<0.05,**P<0.01;與T24光周期比較:#P<0.05,##P<0.01

2.2 短時程光周期影響LHB谷氨酸受體和PCA1受體的表達與T24光周期相比:T7光周期下LHB的PAC1受體變化差異無統計學意義(圖2B),但整體呈現表達減少的趨勢;T7光周期下不同時間點和24 h內GluR1總體的表達差異無顯著性(圖2D);T7光周期下GluR2的總體表達下降(圖2F,P=0.002 4);而T7周期下不同時間點的NR2B差異無顯著性(圖2H)。結果說明,短時程光周期下LHB腦區中谷氨酸受體表達顯著減少,提示小鼠的抑郁樣行為可能與GluR2的表達顯著降低有關。

圖2 T24及T7光周期對LHB的谷氨酸受體和PAC1受體的影響A、C、E、G:T7或T24周期下PAC1、GluR1、GluR2、NR2B受體蛋白表達的代表圖;1:T24;2:T7;B:LHB中PAC1受體的表達;D、F:LHB中GluR1、GluR2的表達;H:LHB中NR2B的表達;與T24光周期蛋白整體表達比較:**P<0.01

2.3 短時程光周期下SCN中下游信號分子的表達與T24光周期相比,T7光周期下SCN中各個時間點CaMK II的表達差異無統計學意義(圖3B);T7光周期下SCN中P-PKA的表達高于T24光周期,但差異無統計學意義(圖3D)。

圖3 T24及T7光周期對SCN中下游信號分子表達的影響A、C:T24或T7光周期下SCN下游信號分子蛋白表達的代表圖;1:T24;2:T7;B:SCN中CaMK II的表達;D:SCN中P-PKA的表達

2.4 短時程光周期對LHB中下游信號分子的表達的影響T7光周期下,LHB中CaMK II表達與T24光周期相比,無顯著性差異(圖4B),而與T24周期相比,T7周期下LHB的P-ERK的表達整體上升(圖4D,P=0.046)。這些結果說明在T7光周期下小鼠產生抑郁樣行為可能是由于上調LHB中P-ERK的表達導致。

圖4 T24及T7光周期對LHB中下游信號分子表達的影響A、C:T7或T24周期下LHB下游信號分子蛋白表達的代表圖;1:T24;2:T7;B:LHB中CaMKII的表達;D:LHB中P-PKA受體的表達;與T24光周期蛋白整體表達比較:*P<0.05

3 討論

研究[3,9]表明,光對于生物節律穩態的調控主要是通過ipRGCs-SCN信號通路。在T24光周期下,PACAP mRNA在ipRGCs中的表達呈現夜間高于白天,且在節律時間(CT)17達到峰值[2]。本研究結果顯示,在T24光周期下,SCN中PAC1受體的表達在ZT 17達到峰值,且在夜間呈上升的趨勢,但T7光周期下在ZT 17 PAC1受體的表達減少。谷氨酸作為ipRGCs末梢釋放的主要神經遞質,谷氨酸-NMDA受體信號通路對維持生物節律性振蕩的穩定具有重要作用[2-3],SCN中NR2B的表達呈晝夜節律性振蕩,且在夜間達到峰值[10]。本研究結果顯示,關燈1 h后NR2B的表達達到峰值,在T7光周期下NR2B的24 h內總體表達量高于正常光周期,提示短時程光照可能擾亂了NR2B表達而影響節律的穩定。研究[2]證實,SCN內主要表達AMPA型受體的mRNA在SCN和周圍區域大量表達。本研究結果顯示,在T7周期下,ZT 1、ZT 5的GluR2的表達上調,但GluR1表達在ZT 13達到峰值,表明短時程光周期可能是通過影響谷氨酸受體的表達從而影響生物節律的穩定。

Fernandez et al[1]驗證了T7光周期可使得小鼠產生抑郁樣行為,同時揭示了短時程光照誘發的抑郁樣情緒與LHB核團神經元活動具有直接關系。LHB是一個較小的雙側上皮核,對厭惡刺激做出反應并進行信息的整合,并促進對未來不良事件的回避來調控情緒[9]。位于LHB的前內側區域的稀疏分布的神經元群體表達PACAP,它也在其他幾個大腦區域表達,并且在應激相關核中表達豐富[8]。本研究結果顯示,在T7周期下,PAC1受體表達減少。睡眠穩態的維持和情緒的調控存在直接關聯,研究[11]表明LHB參與覺醒睡眠周期的調節,其神經元興奮具有促進REM睡眠作用,這也可能是LHB調控情緒的又一機制,睡眠穩態維持與LHB中與情緒調控相關蛋白表達之間的關系有待進一步探索。

阻斷LHB中NMDAR依賴的神經元爆發性活動,可介導氯胺酮在大鼠和小鼠抑郁癥模型中的快速抗抑郁作用[12]。在抑郁癥模型下,激活NMDAR的表達,能提高LHB神經元放電頻率,且特異性阻斷LHB中NMDAR可以挽救享樂缺乏和行為絕望等病理表型[13]。本研究結果顯示,在T7光周期下GluR2的整體表達低于T24光周期,推測短周期光可導致小鼠抑郁樣行為可能與谷氨酸受體的表達異常有關。研究[14]表明,抑郁癥會增加谷氨酸釋放到含有AMPAR的LHB突觸上的概率,并通過CaMK II 蛋白的過表達增強AMPAR功能。本研究表明T7或T24光周期下,CaMK II的表達與AMPAR的表達趨勢一致。