哺乳動(dòng)物細(xì)胞ACBD3敲低對(duì)鐵死亡的影響

邱 榮, 馬山川, 錢 影,曹新旺

鐵死亡是一種可調(diào)控細(xì)胞死亡形式,與發(fā)育、衰老、免疫和癌癥等生理病理過程密切相關(guān)[1]。鐵死亡是由組成細(xì)胞膜的多不飽和脂肪酸在鐵離子和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的作用下生成脂質(zhì)過氧化物,這種脂質(zhì)過氧化物的積累將破壞細(xì)胞膜的完整性,進(jìn)而導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。因此,鐵死亡是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)驅(qū)動(dòng),細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡的結(jié)果[2]。迄今為止,文獻(xiàn)中報(bào)道的誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的方式包括:抑制抗氧化系統(tǒng)XC-;抑制/降解/失活谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4);消耗還原型輔酶Q10;過氧化物、鐵或多不飽和脂肪酸過載等方式[2]。鐵死亡除了可導(dǎo)致細(xì)胞死亡外,在一定程度上還可以消除機(jī)體內(nèi)癌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞或活化的成纖維細(xì)胞,因此,闡明鐵死亡發(fā)生的分子機(jī)制具有重要意義[3]。

ACBD3是一個(gè)含有酰基輔酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域的高爾基體蛋白,又名PAP7 或GCP60,在進(jìn)化上非常保守,廣泛表達(dá)于人體多種組織。ACBD3在細(xì)胞內(nèi)參與多種生理病理過程,如類固醇合成、脂代謝、高爾基體形態(tài)維持、葡糖神經(jīng)酰胺運(yùn)輸、病毒入侵、細(xì)菌增殖以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等[4]。此外,ACBD3亦可通過與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1相互作用維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)[5]。鐵離子過載可導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生,而ACBD3蛋白又參與鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。該研究通過RNA干擾技術(shù)降低細(xì)胞內(nèi)ACBD3表達(dá)水平,研究其在細(xì)胞鐵死亡過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料HeLa細(xì)胞和HEK293細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA、嘌呤霉素及Lipofectamin 2000購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司; ACBD3和β-actin抗體購(gòu)自武漢Proteintech公司;鐵含量檢測(cè)試劑FerroOrange(F374)和Calcein-AM(C326)和耐光型ROS探針(R253)購(gòu)自上海同仁化學(xué)公司;鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3購(gòu)自美國(guó)MCE公司;細(xì)胞活力測(cè)量試劑盒(g7570)購(gòu)自美國(guó)Promega公司;脂質(zhì)過氧化檢測(cè)試劑BODIPY 581/591 C11購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司;激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM800)購(gòu)自德國(guó)蔡司公司;酶標(biāo)儀(Spark)購(gòu)自瑞士帝肯公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HeLa細(xì)胞和HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS和100 μg/ml的青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,設(shè)定培養(yǎng)溫度為37 ℃,CO2含量為5%。

1.3 構(gòu)建ACBD3敲低細(xì)胞株根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)程序,尋找兩條長(zhǎng)度為21 bp的人源ACBD3最優(yōu)靶標(biāo)序列5′-GCAAAGCATTTCATCCAACTT-3′和5′-CCCAGCTCATAGGTGTTCATA-3′。根據(jù)載體pLKO.1 puro(Addgene#8453)雙酶切位點(diǎn)來為靶標(biāo)序列添加酶切接頭,然后按照標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆方法,將寡核苷酸退火后克隆到載體pLKO.1 puro。進(jìn)一步將測(cè)序正確的質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G(Addgene# 12259)以及psPax2(Addgene# 12260)一起共轉(zhuǎn)到HEK293細(xì)胞,48 h后收集病毒上清液,用來感染密度為30%～50%的HeLa細(xì)胞,感染48 h后用濃度為0.5 μg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行篩選,最終得到ACBD3 敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株。ACBD3-shRNA1:(F)C CGGGCAAAGCATTTCATCCAACTTCTCGAGAAGTTG GATGAAATGCTTTGCTTTTTG;(R)AATTCAAAAAG CAAAGCATTTCATCCAACTTCTCGAGAAGTTGGATG AAATGCTTTGC;ACBD3-shRNA2:(F)CCGGCCCAT GAAGAAGGATCATATCCTCGAGGATATGATCCTTCT TCATGGGTTTTTG,(R)AATTCAAA-AACCCATGAA GAAGGATCATATCCTCGAGGATATGATCCTTCTTCA TGGG。

將以上細(xì)胞分別分為3組:野生型Hela細(xì)胞為對(duì)照組;使用shRNA1序列的敲低細(xì)胞為ACBD3 sh1組;使用shRNA2序列的敲低細(xì)胞為ACBD3 sh2組。

1.4 Western blot檢測(cè)將3組細(xì)胞分別用PBS洗1次,然后用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液(pH 7.4的50 mmol/L Hepes, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 1%Triton X-100)在冰上裂解30 min,接著進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用相應(yīng)的一抗和二抗進(jìn)行孵育,將PVDF膜放在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像,檢測(cè)目標(biāo)蛋白條帶。

1.5 細(xì)胞活力測(cè)定在96孔板中分別接種3組細(xì)胞 (密度為6×104個(gè)/ml),培養(yǎng)過夜。第2天按照40、16、6.4、2.56、1.024 μmol/L共5個(gè)濃度梯度加入RSL3,培養(yǎng)24 h后,除去培養(yǎng)基,加入50 μl不含F(xiàn)BS的DMEM,再加入50 μl CellTiter-Glo工作液,避光混勻5 min后,靜置5 min,然后用酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光值。

1.6 細(xì)胞ROS檢測(cè)在96孔板中接種3組細(xì)胞(密度為1×105個(gè)/ml),培養(yǎng)過夜,次日除去培養(yǎng)基,用HBSS清洗2次,加入高度敏感的DCFH-DA染料工作液,在培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min后,移去工作液,用HBSS清洗2次,再加入HBSS,然后用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.7 細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物檢測(cè)將密度為1×105細(xì)胞/ml 的3組細(xì)胞接種于96孔板中,培養(yǎng)過夜,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步分成6組,分別為野生型細(xì)胞、ACBD3 sh1、ACBD3 sh2、野生型細(xì)胞+RSL3、ACBD3 sh1+RSL3、ACBD3 sh2+RSL3。次日除去培養(yǎng)基,加入或不加入DMEM 培養(yǎng)基稀釋的10 μmol/L RSL3溶液,培養(yǎng)1 h后,清洗細(xì)胞2次,添加 BODIPY 581/591 C11工作液,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min后移去培養(yǎng)基,用HBSS清洗細(xì)胞2次后,再次加入HBSS,用激光共聚焦顯微鏡成像。

1.8 細(xì)胞游離Fe2+含量測(cè)定接種3組細(xì)胞于96孔板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,第2天先棄去培養(yǎng)基,再用HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次,然后加入濃度為1 μmol/L的FerroOrange工作液,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后,無(wú)需清洗,直接用熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。

1.9 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總鐵含量在96孔板中接種3組細(xì)胞,培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),第2天,移去培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞2～3次,每孔加入100 μl濃度為2 μmol/L的Calcein-AM溶液,在培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～30 min后棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞2次,后加入HBSS溶液,用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 ABCD3敲低對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3作用下細(xì)胞活力的影響Western blot分析顯示,與對(duì)照組細(xì)胞相比,用兩種含有不同ACBD3 shRNA病毒處理的細(xì)胞中ACBD3表達(dá)水平降低(P<0.001)。細(xì)胞活力分析實(shí)驗(yàn)顯示,與野生型細(xì)胞(對(duì)照組)相比,ACBD3敲低組細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3更為敏感,在RSL3濃度為2.56 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力即已下降了90%,細(xì)胞活力降低(F=32.231,P<0.001);而野生型細(xì)胞在RSL3濃度達(dá)到16 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力才明顯下降(P<0.001)。兩個(gè)ACBD3敲低組細(xì)胞在不同RSL3濃度下的細(xì)胞活力無(wú)明顯差異。見圖1。

圖1 RSL3作用下野生型細(xì)胞和ACBD3敲低組細(xì)胞細(xì)胞活力比較A:Western blot檢測(cè)對(duì)照組和ACBD3敲低組細(xì)胞中ACBD3的表達(dá)水平;a:對(duì)照組;b:ACBD3 sh1組;c:ACBD3 sh2組;B:不同給藥濃度下的細(xì)胞活力;與RSL3同一給藥濃度敲低組比較:***P<0.001;與6.4 μmol/L RSL3濃度下的對(duì)照組比較: ###P<0.001

2.2 ACBD3敲低對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平的影響在野生型細(xì)胞和ACBD3敲低組細(xì)胞中,分別不加入或加入10 μmol/L RSL3,然后利用BODIPY 581/591 C11檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化。BODIPY 581/591 C11探針分子通過與脂質(zhì)過氧化時(shí)產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平。未發(fā)生反應(yīng)的探針發(fā)出紅色熒光,而發(fā)生反應(yīng)后的探針由紅色變?yōu)榫G色,因此,可以利用相對(duì)熒光強(qiáng)度(綠色/紅色)來表征細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平改變。結(jié)果顯示,與野生型細(xì)胞相比,ACBD3敲低組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化增加(F=25.261,P<0.001)。RSL3處理后,相應(yīng)組細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(F=30.337,P<0.001);與野生型細(xì)胞相比,ACBD3敲低組細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平增加(F=28.732,P<0.001)。兩不同ACBD3敲低組細(xì)胞在RSL3不存在或存在條件下脂質(zhì)過氧化水平無(wú)明顯差異。見圖2。

圖2 BODIPY 581/591 C11標(biāo)記野生型細(xì)胞和敲低組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平比較A～C:野生型細(xì)胞、ACBD3 sh1細(xì)胞、ACBD3 sh2細(xì)胞的熒光圖像 ×40;1:未使用RSL3處理的綠色熒光圖像;2:未使用RSL3處理的紅色熒光圖像;3:RSL3處理的綠色熒光圖像;4:RSL3處理的紅色熒光圖像;D:各組細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;a:野生型細(xì)胞;b:ACBD3 sh1;c:ACBD3 sh2;d:野生型細(xì)胞+RSL3;e:ACBD3 sh1+RSL3;f:ACBD3 sh2+RSL3;與野生型細(xì)胞比較:***P<0.001;與野生型細(xì)胞+RSL3比較:###P<0.001

2.3 ACBD3敲低對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的影響利用耐光性ROS探針檢測(cè)野生型細(xì)胞和ACBD3敲低組細(xì)胞ROS水平。結(jié)果表明,與野生型細(xì)胞相比,ACBD3敲低組細(xì)胞中ROS水平升高(F=33.261,P<0.001),而兩個(gè)ACBD3敲低組細(xì)胞ROS濃度無(wú)明顯差異。見圖3。

圖3 ROS探針標(biāo)記野生型細(xì)胞和ACBD3敲低組細(xì)胞ROS水平比較A: ROS探針標(biāo)記野生型細(xì)胞和ACBD3敲低組細(xì)胞 ×40;B:各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;1:對(duì)照組;2:ACBD3 sh1組;3:ACBD3 sh2組;與對(duì)照組比較:***P<0.001

2.4 ACBD3敲低對(duì)細(xì)胞內(nèi)總鐵含量和Fe2+水平的影響利用熒光探針Calcein-AM測(cè)量細(xì)胞中的總鐵含量,該探針螯合細(xì)胞中鐵離子后其熒光將會(huì)淬滅。因此,Calcein-AM標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞中總鐵含量呈負(fù)相關(guān)。測(cè)量結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,ACBD3敲低組細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(F=19.205,P<0.001),但兩個(gè)ACBD3敲低組細(xì)胞間熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,與對(duì)照組細(xì)胞相比,ACBD3敲低組細(xì)胞內(nèi)總鐵含量明顯下降。

利用FerroOrange探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度,該探針結(jié)合細(xì)胞內(nèi)Fe2+后熒光強(qiáng)度會(huì)隨鐵離子濃度增加。結(jié)果顯示,與對(duì)照組細(xì)胞相比,ACBD3敲低組細(xì)胞中熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(F=26.379,P<0.001),但兩個(gè)ACBD3敲低組細(xì)胞間熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,與對(duì)照組細(xì)胞相比,ACBD3敲低組細(xì)胞Fe2+濃度升高。見圖4。

圖4 野生型細(xì)胞與ACBD3敲低組細(xì)胞內(nèi)總鐵含量和Fe2+水平比較A:Calcein-AM探針標(biāo)記對(duì)照組和ACBD3敲低組細(xì)胞 ×40;B:各組細(xì)胞內(nèi)總鐵含量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;C:FerroOrange探針標(biāo)記對(duì)照組和ACBD3敲低組細(xì)胞 ×40;D:各組細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;1:對(duì)照組;2:ACBD3 sh1組;3:ACBD3 sh2組;與對(duì)照組比較:***P<0.001

3 討論

鐵死亡是一種鐵依賴的細(xì)胞膜氧化損傷進(jìn)而引發(fā)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡,與細(xì)胞凋亡、壞死和細(xì)胞自噬存在較大區(qū)別[6]。近年來,多項(xiàng)研究[7-8]表明,鐵死亡在腫瘤抑制以及某些癌癥治療過程中發(fā)揮重要作用,因此,靶向誘導(dǎo)鐵死亡已成為腫瘤研究熱點(diǎn)之一。

細(xì)胞膜中含有大量磷脂分子,它們由單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸組成。在ROS和鐵離子存在的條件下,多不飽和脂肪酸可被氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物,從而引起細(xì)胞膜破損,導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡[1]。在生理?xiàng)l件下,細(xì)胞可利用自身的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控,避免細(xì)胞膜損傷。因此,測(cè)定脂質(zhì)過氧化物是研究細(xì)胞鐵死亡的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。本研究中,ACBD3敲低組細(xì)胞顯著增加了對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3的敏感性,在RSL3濃度為2.56 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力顯著下降。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ACBD3敲低可使細(xì)胞內(nèi)ROS水平提高、脂質(zhì)過氧化水平明顯增加。

維持細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞進(jìn)行正常生理功能的必要條件,破壞鐵穩(wěn)態(tài)將導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生多種病變[9]。例如,鐵過載引發(fā)的鐵死亡在多種心血管疾病發(fā)展過程中有重要作用[10]。Cheah et al[5]報(bào)道,ACBD3可與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1相互作用,它們與Ras超家族G蛋白Dexras1一起,維持細(xì)胞內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)。鐵離子的存在是發(fā)生鐵死亡不可或缺的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ACBD3敲低導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度顯著提高,進(jìn)一步證實(shí)敲低ACBD3促進(jìn)了細(xì)胞鐵死亡過程,但是,ACBD3敲低導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度升高的的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

ACBD3在亨廷頓舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病患者以及乳腺癌等腫瘤患者中表達(dá)量均顯著上調(diào)[11-12]。神經(jīng)退行性疾病患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域可發(fā)生明顯的細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象。鐵死亡在腫瘤的放射治療過程中亦具有重要作用[13]。因此,闡明ACBD3在鐵死亡過程中的作用機(jī)制,合理干預(yù)細(xì)胞鐵死亡進(jìn)程,可為相關(guān)疾病的診療提供重要解決方案。