實驗性血小板微粒對葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性的影響

楊 彬,李會會,張路遙,劉秋圓,王迪迪,胡 靜,韓 瑋,劉曉昌,梅 俏

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確的消化道慢性非特異炎癥性疾病,遺傳、環(huán)境、感染和免疫等多因素相互作用引起的腸道黏膜免疫異常是IBD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。一般認(rèn)為,病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern, DAMP)是致病因素激發(fā)腸道免疫炎癥損傷的重要途徑[1]。血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)能夠表達(dá)多種DAMP信號分子、參與機(jī)體的炎癥免疫反應(yīng)。多項研究[2-4]表明,IBD患者外周血PMPs水平顯著升高且與疾病活動程度正相關(guān)。IBD患者損傷的腸道組織局部可見大量中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)形成[5],而抑制NETs形成可以有效減輕結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸炎癥病變,表明NETs在腸黏膜損傷機(jī)制中發(fā)揮重要作用[6]。IBD患者高表達(dá)的PMPs可通過誘導(dǎo)NETs形成參與引發(fā)高凝狀態(tài)和血栓形成[7],而系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)研究中,血小板可通過釋放含有HMGB1的PMPs途徑激活中性粒細(xì)胞促進(jìn)NETs的形成,進(jìn)而促進(jìn)疾病進(jìn)展[8]。但在IBD中,PMPs是否通過誘導(dǎo)NETs的形成促進(jìn)腸道炎癥以及NETs對腸黏膜通透性的作用尚未見報道。該研究通過對DSS結(jié)腸炎小鼠腹腔注射PMPs,觀察NETs的形成情況和結(jié)腸炎癥及黏膜通透性的變化,以探討PMPs作用于IBD結(jié)腸黏膜的可能機(jī)制,為IBD的病理生理機(jī)制研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取6～8周齡、體質(zhì)量20.0 g±2.0 g的雄性C57BL/6小鼠,購自安徽省動物中心,將所有動物飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF動物房,保持恒溫恒濕、12 h/12 h光暗周期環(huán)境。

1.2 主要試劑和儀器葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)、異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate dextran,FITC-D)和Ⅰ型膠原購自美國Sigma公司;髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、組蛋白H3(citH3)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-10和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司;BCA法微量蛋白檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;枸櫞酸鹽緩沖液、EDTA溶液和改良型臺氏液(modified Tyrode′s buffer, MTB)為實驗室自行配制。MQX200酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司,透射電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.3 PMPs懸液制備采集IBD患者清晨肘靜脈血5 ml,枸櫞酸鈉管抗凝。樣本立即2 000 r/min離心5 min,收集上層富血小板血漿,進(jìn)一步將富血小板血漿4 000 r/min離心5 min得到血小板沉淀,經(jīng)枸櫞酸鹽緩沖液洗滌后重懸于MTB中。調(diào)整血小板懸液濃度為3×108/ml,加入Ⅰ型膠原(20 mg/ml)激活血小板,30 min后加入EDTA(20 mmol/l)中止活化,隨后2 000 r/min離心5 min(2次)。收集上清液,20 000 r/min離心90 min,得到PMPs沉淀并懸浮于MTB中。BCA法檢測懸液PMPs濃度并稀釋至0.2 μg/ml,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動物分組、造模、給藥和觀察小鼠正常飲食7 d適應(yīng)環(huán)境后,通過用5% DSS代替飲用水7 d(從第1天到第7天)誘導(dǎo)實驗性結(jié)腸炎。所有小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只:① 正常對照組(normal control, NC):正常飲水,腹腔注射生理鹽水;② PMPs組:正常飲水,腹腔注射PMPs;③ DSS組:DSS飲水+腹腔注射生理鹽水;④ 實驗組:DSS飲水+腹腔注射PMPs。PMPs每天注射1次(0.1 ml,濃度0.2 μg/ml),對照組注射同體積生理鹽水。末次給藥后麻醉、處死小鼠,收集腸道組織標(biāo)本。每天定時對各組小鼠進(jìn)行體質(zhì)量稱量、觀察大便性狀,并進(jìn)行糞便隱血檢測等,參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)統(tǒng)計。取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織用10%甲醛固定,石蠟包埋,HE染色,參照文獻(xiàn)[9]對小鼠結(jié)腸進(jìn)行病理組織學(xué)評分(histopathological index,HI)。

1.5 結(jié)腸組織勻漿炎癥因子及NETs水平檢測取結(jié)腸黏膜組織在冷生理鹽水中勻漿,離心后取上清液,按試劑盒說明進(jìn)行MPO、NE、citH3與炎癥因子IL-1β、IL-10和TNF-α含量的測定,相對熒光定量法用于檢測游離DNA含量。

1.6 腸黏膜通透性檢測小鼠禁食8 h后,按500 mg/kg對小鼠進(jìn)行FITC-D(濃度125 mg/ml)灌胃操作,4 h后對小鼠進(jìn)行水合氯醛腹腔注射麻醉,經(jīng)門靜脈取血100 μl,立即用1.9 ml Tris液(50 mol/L)稀釋,4 000 r/min離心10 min后取上清液用酶標(biāo)儀(激發(fā)波長480 nm和發(fā)射波長530 nm)測定FTIC-D含量[9]。

1.7 腸黏膜超微結(jié)構(gòu)透射電鏡分析將小鼠腸黏膜組織置于預(yù)冷的載玻片上,浸入2.5%戊二醛溶液后切成0.5～1 mm2小塊,置于2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定6 h。PBS沖洗,1%四氧化鋨溶液固定,不同濃度乙醇梯度脫水后,置于60 ℃恒溫箱環(huán)氧樹脂固化48 h。超薄切片,枸櫞酸鉛染色,漂洗、干燥后使用透射電子顯微鏡觀察腸黏膜組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠DAI評分和結(jié)腸病理損傷程度的影響NC組小鼠無血便和體質(zhì)量下降等癥狀,結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整、腺體排列整齊、無炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)。DSS組小鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕,出現(xiàn)稀糊狀大便和肉眼血便,DAI和HI評分較NC組升高(P<0.01,圖2);DSS組小鼠光鏡下可見結(jié)腸黏膜水腫增厚,腸黏膜上皮細(xì)胞損傷,部分腺體變形,杯狀細(xì)胞減少,局部可見大量炎細(xì)胞浸潤(圖1B)。以上表明DSS結(jié)腸炎小鼠模型構(gòu)建成功。PMPs組小鼠DAI評分與NC組接近,但HI評分升高(P<0.01,圖2);結(jié)腸病理表現(xiàn)為腸黏膜局部水腫,腺體結(jié)構(gòu)輕度變形,杯狀細(xì)胞大致正常,局部可見炎細(xì)胞浸潤(圖1B);提示PMPs可能具有一定的致炎作用。實驗組小鼠血便等癥狀較DSS組重,DAI和HI評分略高于DSS組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。病理可見結(jié)腸黏膜腫脹、腺體結(jié)構(gòu)受損、隱窩變形、炎性細(xì)胞廣泛浸潤(圖1B)。上述結(jié)果提示,PMPs加重了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

圖1 實驗性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量及腸黏膜病理改變 A:PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量的影響;B:DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜病理損傷HE ×200;1:NC組;2:PMPs組;3:DSS組;4:實驗組

圖2 PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸DAI、HI評分的影響A:DAI評分;B:HI評分;與NC組比較:**P<0.01;與DSS組比較:##P<0.01

2.2 PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸炎癥因子水平的影響ELISA法檢測小鼠結(jié)腸組織勻漿中炎癥因子IL-1β、IL-10及TNF-α的表達(dá)水平,結(jié)果如圖3所示。相較于NC組,PMPs組、DSS組及實驗組促炎因子IL-1β、TNF-α水平均升高(F=242.226、449.459,P<0.05);其中DSS組與實驗組TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜組織炎癥因子表達(dá)水平的影響與NC組相比較:*P<0.05;與DSS組相比較:#P<0.05

與NC組相比,PMPs組、DSS模型組及實驗組IL-10均降低(F=104.062,P<0.05);其中DSS組與實驗組IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。DSS模型組小鼠經(jīng)PMPs干預(yù)后, IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05),IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸NETs水平的影響在共聚焦顯微鏡下無法直接觀察到PMPs誘導(dǎo)DSS結(jié)腸炎小鼠形成NETs,故以小鼠結(jié)腸黏膜中檢測NETs成分(MPO、NE和citH3)水平來反映NETs的形成。如圖4所示,相較于NC組,DSS組MPO、NE和citH3水平稍增高(P<0.05),游離DNA水平降低(P<0.05);PMPs組MPO、NE 和citH3水平均升高(P<0.05)。與DSS組相比,實驗組小鼠結(jié)腸組織MPO、NE和citH3表達(dá)水平增加,游離DNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。結(jié)果提示PMPs誘導(dǎo)DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜組織NETs形成。

圖4 PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜組織NETs成分表達(dá)水平的影響與NC組比較:*P<0.05;與DSS組比較:#P<0.05

2.4 PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性的影響如圖5所示,與NC組比較,PMPs組、DSS組和實驗組小鼠血漿FITC-D水平更高(P<0.05);與DSS組比較,實驗組小鼠的血漿FITC-D水平明顯增高(P<0.05)。以上結(jié)果提示PMPs可增加小鼠腸黏膜的通透性,可能進(jìn)一步加重結(jié)腸炎癥。

圖5 PMPs對DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性的影響與NC組比較:*P<0.05;與DSS組比較:#P<0.05

進(jìn)一步使用透射電鏡對小鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,如圖6所示。NC組小鼠腸黏膜微絨毛較長,排布緊密有序,細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)完整(圖6A);PMPs組可見腸微絨毛輕度萎縮,局部排列變稀疏,細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)尚清晰,緊密程度輕度降低(圖6B);DSS組可見結(jié)腸微絨毛明顯萎縮甚至缺失,細(xì)胞間連接復(fù)合體縮短變寬,細(xì)胞間隙擴(kuò)大,部分緊密連接開放(圖6C)。與DSS組相比,實驗組小鼠同樣出現(xiàn)微絨毛萎縮缺失,排列稀疏,細(xì)胞間隙增大,但細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)更加模糊(圖6D)。以上結(jié)果提示PMPs可能加重DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)的損傷,增加腸黏膜通透性。

圖6 小鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu)圖 ×2 000A:NC組;B:PMPS組;C:DSS組;D:實驗組

3 討論

IBD發(fā)病機(jī)制尚不十分明確,目前認(rèn)為腸黏膜屏障損傷和腸道菌群紊亂具有重要作用。腸黏膜通透性增加,細(xì)菌和內(nèi)毒素等致病因素通過病原相關(guān)分子模式和DAMP激發(fā)免疫反應(yīng)和炎癥損傷。其中,DAMP多來源于機(jī)體組織或細(xì)胞損傷釋放的信號分子,通過識別細(xì)胞中的PRR受體,誘導(dǎo)炎癥和免疫損傷的發(fā)生[10]。研究[8]表明,含有大量DAMP信號的細(xì)胞微粒與炎癥免疫損傷過程密切相關(guān)。

PMPs是體內(nèi)含量最高的細(xì)胞微粒,除了具有抗凝作用外,還兼具傳遞生物信息、參與炎癥免疫反應(yīng)的功能。大量研究[11-12]表明,PMPs可以參與血栓形成、觸發(fā)炎癥反應(yīng),在糖尿病、心血管疾病以及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。IBD發(fā)病常伴血小板增多,既往研究提示IBD患者存在PMPs表達(dá)上調(diào)[13],研究[4]結(jié)果顯示IBD患者循環(huán)和腸組織中PMPs的表達(dá)水平均與疾病活動程度正相關(guān),且PMPs能夠在體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs,這些結(jié)果提示PMPs可能通過誘導(dǎo)NETs形成參與腸道炎癥活動。

NETs是由活化的中性粒細(xì)胞釋放的纖維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),含有NE、組蛋白H3、抗菌蛋白等高效抗菌成分,在糖尿病、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病和癌癥等疾病過程中均發(fā)揮重要作用[14]。在IBD活動期,患者體內(nèi)PMPs水平升高,并通過與中性粒細(xì)胞作用形成NETs,加重結(jié)腸組織損傷,觸發(fā)血栓形成[7, 15]。本研究在構(gòu)建DSS結(jié)腸炎小鼠的基礎(chǔ)上,通過PMPs腹腔注射,發(fā)現(xiàn)PMPs可以加重小鼠的結(jié)腸炎癥。通過電鏡和FITC-D檢測,發(fā)現(xiàn)PMPs干預(yù)后小鼠腸上皮細(xì)胞損傷加重,表現(xiàn)為炎細(xì)胞廣泛浸潤、腺體破壞、細(xì)胞間連接疏松,腸黏膜通透性增加。本研究未能在結(jié)腸免疫熒光實驗中直接觀察到NETs形成,推測可能是由于NETs具有不穩(wěn)定性和易分解性,腸道蠕動導(dǎo)致NETs清除速度較快,以及DSS結(jié)腸炎模型中結(jié)腸隱窩膿腫數(shù)量不足等原因。但實驗組在注射PMPs后結(jié)腸黏膜組織勻漿MPO、NE及citH3等NETs成分含量的明顯增加,間接反映小鼠結(jié)腸黏膜中NETs的形成,表明PMPs能夠誘導(dǎo)NETs形成,增加DSS結(jié)腸炎小鼠的腸黏膜通透性。

該研究表明,PMPs可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)NETs形成,增加DSS結(jié)腸炎小鼠的腸黏膜通透性。但有關(guān)NETs對腸屏障功能的影響機(jī)制研究尚不深入,可能與其對腸上皮細(xì)胞的直接毒性作用和抑制炎癥因子釋放有關(guān);PMPs如何與中性粒細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)NETs形成、進(jìn)而影響腸道黏膜免疫,仍需進(jìn)一步研究。