2.5%NaClO溶液沖洗對大鼠炎癥牙髓愈合影響

楊 琪,唐 穎,李午麗,陳喬爾,孫 麟,李 頌

活髓保存治療(vital pulp therapy,VPT),即旨在保存和維持因廣泛的齲壞、牙齒外傷、修復治療或醫源性原因而受損的牙髓組織[1]。次氯酸鈉(NaClO)是VPT過程中常用的藥物,已經證實其具備良好的抗菌和止血性能以及優異的組織溶解能力[2]。最近的一項對96例有輕微癥狀的不可復性牙髓炎患者進行的VPT試驗中,發現使用2.5% NaClO沖洗顯著減少了術后疼痛和治療失敗[3]。另有臨床研究[4]也表明,與生理鹽水相比,使用2.5%NaClO可以顯著抵消牙髓炎癥中高MMP9/TP值帶來的炎癥變化。這些研究足以提示,當NaClO沖洗應用于存在不可復性炎癥和壞死感染的牙髓炎創面上時,可能會對其剩余牙髓組織的愈合產生有利影響,但在此方面并沒有組織學證據。

該研究采用建立大鼠不可復性炎癥牙髓模型并模擬臨床牙髓部分切斷術的方式,使用2.5%NaClO作為iRoot BP Plus蓋髓前的沖洗劑,評估NaClO對炎癥牙髓愈合和修復過程的影響,為臨床不可復性牙髓炎保存活髓的治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只8周齡雄性SD大鼠(SPF級)購自安徽醫科大學實驗中心并飼養,體質量200 g±10 g,身體發育良好,恒牙列完整,口腔衛生良好,無齲齒及其他牙體牙周疾病。

1.2 主要試劑與儀器移動式牙科治療機(型號:BD-402)購自廣州超盛醫療器械有限公司;高速渦輪手機(型號:Pana-Max2 M4)購自日本NSK公司;DG16探針(型號0710-6D1)購自意大利ASA公司;牙科光敏刀(型號:008-0118)購自上海偉榮醫療器械有限公司;根管沖洗針頭(型號:ORN-30G-22-3-B-M-S)購自河南佩朗醫療器械有限公司;球鉆(型號:BR-49;BR-45)購自日本MANI公司;NaClO消毒液(貨號:190901)購自武漢朗力生物有限公司;生理鹽水(貨號:L139053009)購自四川科倫藥業股份有限公司;iRoot BP Plus(型號:IRBPP 4610 J3)購自加拿大Innovative Bioceramix Inc公司;玻璃離子水門汀(型號:Ketac Molar Easymix)購自美國3M公司。

1.3部分不可復性牙髓炎炎癥模型[5]建立選取24只大鼠,其中20只大鼠稱重后用2%戊巴比妥鈉按50 mg/kg計量予以腹腔注射麻醉,取仰臥位固定于手術臺上,0.5%碘伏消毒口腔及周圍組織,用高速渦輪手機攜BR-49號球鉆在水冷卻的條件下于雙側上頜第一磨牙的咬合面中央窩處間斷鉆磨,直至窩洞底部透粉紅,隨后換用 DG16 探針稍加壓力穿髓,穿髓孔的直徑約為0.35 mm,可見輕微出血點即為穿髓成功的標志。保持髓腔開放,根據牙髓暴露時間不同隨機分為5組,即開放6、12、24、48、72 h組,每組4只。剩余4只不做處理作為對照組。術后采集標本,組織切片HE染色顯示:開放24 h組牙髓組織均表現為輕度至中度的炎性病變以及小部分冠髓的壞死,根髓可見部分血管擴張充血(圖1)。因此選擇牙髓開放24 h模型作為此次實驗所需的部分不可復性牙髓炎炎癥模型。

圖1 預實驗HE染色顯示髓腔暴露24 h牙髓組織出現部分不可復性牙髓炎組織學表現A:完整牙髓 ×50;B:開髓孔周圍 ×200

1.4 實驗動物模型建立另選取24只大鼠,隨機分為2組,即2.5%NaClO沖洗(NaClO)組和生理鹽水沖洗(NS)組,每組12只,以雙側上頜第一磨牙為實驗牙。采用上述步驟髓腔暴露24 h后,大鼠再次被麻醉,0.5% 碘伏消毒口內及口周組織,用高速渦輪手機攜BR-45號球鉆在水噴霧冷卻下高速切除表面感染壞死的牙髓并制備窩洞,大小為深度(1.0±0.1)mm,近遠中寬度(1.2±0.1)mm,頰舌寬度(1.0±0.1)mm,每次備洞使用一個新鉆頭。隨后NaClO組和NS組分別用2.5%NaClO溶液和生理鹽水沖洗30 s,再用分別浸泡其中的無菌棉球固定3 min(所有標本均可達到止血),然后使用iRoot BP Plus蓋髓,玻璃離子水門汀嚴密充填。適當調低對頜磨牙,整個實驗過程嚴格按照無菌操作標準進行,均由同一名經驗豐富的主治醫師獨立完成以上操作。

1.5 實驗標本的制備分別于術后第1、7、28天每組隨機取樣4只,采用心臟灌注固定處死大鼠,迅速分離出含有雙側上頜第一磨牙的上頜骨并立即置于4%多聚甲醛中體外固定48 h。將固定好的標本放入10%的EDTA( pH=7.4) 溶液中,25 ℃恒溫下脫鈣4～5周,流水沖洗12 h,經脫水、透明、浸蠟處理,常規石蠟包埋,沿平行于牙體長軸方向做近遠中向連續切片,厚度為4 μm,用于HE染色。

1.6 組織病理結果及分析光學顯微鏡下觀察大鼠牙髓組織切片,采用組織學評分標準[6](表1),評估包括炎癥細胞反應、組織破壞程度、修復性牙本質形成三種組織學特征并計分。

表1 牙髓組織學評分標準

1.7 統計學處理采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。用Shapiro-Wilk檢驗分析不服從正態分布數據。等級資料數據以頻數表示。采用 Mann-WhitneyU檢驗對兩實驗組的牙髓組織炎癥反應、組織破壞及牙本質橋形成程度評分進行統計分析,按α=0.05水準,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各實驗組組織病理學表現

2.1.1術后第1天 NaClO組所有樣本牙(8例)髓腔開孔處部分牙髓組織缺失,可見少量或輕度炎性細胞浸潤,周圍成牙本質細胞排列紊亂,血管擴張充血,根髓組織形態基本正常(圖2A);3例出現創面周圍成牙本質細胞空泡性變,8例樣本均未見修復性牙本質形成。NS組8例樣本均表現為髓腔開孔處周圍伴有少量炎癥細胞或輕度的炎性浸潤(圖2B),血管增生擴張,成牙本質細胞層排列紊亂,根髓組織形態正常;其中5例樣本可見創面下部分牙髓組織變性,所有樣本均無修復性牙本質形成。

圖2 術后第1天HE染色組織學表現A:NaClO組;B:NS組;1:×20;2:×50;3:×200

2.1.2術后第7天 NaClO組只有1例表現為重度炎癥,根髓出現牙髓壞死。其余樣本表現為少量散在炎癥細胞或輕中度的炎性細胞浸潤,較深的牙髓組織形態基本正常,伴有擴張充血(圖3)。其中5例樣本有不同程度的硬組織沉積。NS組有3例表現為中度炎性細胞浸潤(1例髓腔內膿腫形成),炎性浸潤達根管中上端1/3, 血管擴張明顯;有2例出現了部分根髓的壞死,2例硬組織沉積形成。見表2。

表2 牙髓炎癥反應、組織破壞程度及修復性牙本質形成情況統計表

圖3 術后第7天HE染色組織學表現A:NaClO組;B:NS組;1:完整牙髓 ×20;2:冠髓 ×50;3:根髓 ×200

2.1.3術后第28天 NaClO組中6例樣本表現為開髓口下方存在局限性的牙髓壞死區和少量或輕度炎性浸潤,剩余2例伴有根髓的炎癥和壞死。一半樣本(4例)根髓有不同程度的牙髓組織變性。所有樣本均有不同程度的硬化橋形成。其中4例形成了厚而均勻的修復性牙本質延續至根端(圖4A)。NS組有2例出現了中重度的炎癥反應和根髓的壞死,其余6例有少量或輕度炎性浸潤,伴有血管增生擴張。3例樣本表現為根髓組織纖維樣變,所有樣本均有不同程度的修復性牙本質形成,一直延伸至根髓(圖4B)。

圖4 術后第28天HE染色組織學表現A:NaClO組;B:NS組;1:完整牙髓×20;2:冠髓×50;3:根髓×200

2.2 各實驗組炎癥反應、組織破壞程度及修復性牙本質形成情況分析與統計結果根據上述的炎癥反應、組織破壞程度及修復性牙本質形成情況的分級標準,對不同時間點各實驗組進行評分、整理、分析如下(表2)。統計結果顯示,NaClO組和NS組的牙髓炎癥反應、組織破壞程度和修復性牙本質形成分別在術后第1、7、28天差異無統計學意義。表明兩種沖洗劑表現出相似的作用。而術后時間對炎癥和組織的影響差異也無統計學意義。但與NS組不同的是,NaClO組在第7天更早更多地形成了修復性牙本質,與第1天相比差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

臨床上,牙髓疾病的診斷主要是依據患者的主觀癥狀、客觀的臨床檢查和放射學結果,而不是組織學結果。然而,這些臨床診斷結果并不能準確反映牙髓組織的真實狀態。即使有臨床研究顯示不可復性牙髓炎的牙齒采取VPT有較好的療效,也不代表組織學成功,因為其也可能在沒有臨床癥狀和放射學證據的情況下發生治療失敗的結果,短期的成功率并不能說明治療成功。因此,不可復性牙髓炎的活髓保存治療仍然需要更多的組織學研究。本研究采用了動物炎癥牙髓模型,模擬臨床治療程序,首次通過組織學觀察,直觀了解炎癥牙髓經牙髓切斷保存活髓治療后其生物學反應和愈合潛力,為臨床治療判斷預后提供參考。

本研究表明使用NaClO和生理鹽水兩種沖洗劑的牙髓在術后第1、7、28天表現出近似的炎癥反應和牙髓變性表現。Elias et al[7]曾通過組織學研究評估人類牙髓使用NaClO作為沖洗止血劑對直接蓋髓反應的影響,結果表明NaClO并不會影響牙髓修復;?zgur et al[8]將2.5%NaClO和生理鹽水隨機分配,用于齲源性露髓的未成熟恒磨牙部分牙髓切斷術中的傷口沖洗,結果顯示,2.5%NaClO消毒效果與生理鹽水無顯著性差異。在本研究中,NaClO首次用于處理炎癥牙髓創面,其表現與生理鹽水組基本相似,提示使用NaClO沖洗并未干擾炎癥牙髓的自我修復反應,這與前述在健康牙髓上的研究結果一致。本研究為臨床操作中創面沖洗劑的選擇提供更多參考。

本研究同時觀察了炎癥牙髓組織的愈合情況,結果顯示,經活髓切斷治療28 d后,炎癥牙髓并沒有完全恢復健康,根髓仍然存在炎癥表現,部分出現牙髓變性。此結果與Ricucci et al[9]報道的“愈合牙髓(healed pulp)”的組織學特征相吻合。其在對根髓牙本質復合體應對深齲或修復的組織學研究中將牙髓變化分為四類,分別為可逆的牙髓組織學變化、不可逆的牙髓組織學變化、正常完整的牙髓和愈合的牙髓。其中“愈合的牙髓”表現為牙髓沒有明顯的炎性細胞積聚,但與正常組織學檢查結果存在偏差,即有散在的炎性細胞、血管擴張充血、牙髓纖維化和正常成牙本質細胞層的減少。同時本實驗結果也與先前報道的人類恒牙活髓切斷術后的根髓變化相似,賈瑞芝 等[10]曾發現經VPT的根髓組織可發生成牙本質細胞空泡性變、細胞減少、纖維增多等退行性表現。本研究結果提示,對于炎癥牙髓采取活髓保存治療時,雖然牙髓的活力可以通過部分切除壞死的牙髓來維持,但剩余牙髓組織可能仍存在程度不等的炎癥表現和組織變性。

本研究表明NaClO組在更早時間更多地形成了修復性牙本質。推測其原因可能是因為NaClO能夠溶解礦化的牙本質基質、釋放生長因子,尤其是TGF-β[11]。研究[12]已經證明,TGF-β1和TGF-β3亞型能夠刺激成牙本質細胞分泌細胞外基質,從而刺激三期牙本質沉積。而在此之前,Silva et al[13]也曾通過組織學研究比較生理鹽水、NaClO和氯己定作為止血劑對氫氧化鈣覆蓋的人牙髓組織學反應的影響,其研究發現NaClO在90 d時比三種藥物在7 d時表現出更多的三期牙本質。在術后第28天,本研究觀察到兩組所有樣本均有不同程度的修復性牙本質形成,同時還觀察到新形成的三期牙本質一直延續至根端,這與Minic et al[14]發現在VPT后愈合的牙齒的根管壁上存在的管狀第三級牙本質結果一致,認為形成的這種修復組織類似于礦化的纖維疤痕組織,并不是真正的管狀牙本質。

雖然NaClO溶液廣泛應用于活髓保存治療過程之中,但是其對炎癥牙髓的保存治療是否有效尚缺乏組織學實驗證據。本研究首次采用動物不可復性炎癥牙髓模型,通過組織學觀察研究NaClO作為蓋髓前沖洗是否對剩余牙髓組織的愈合產生影響。結果表明,2.5%NaClO和生理鹽水作為iRoot BP Plus蓋髓前沖洗劑表現出相似的作用,并未對炎癥牙髓的愈合過程產生影響,該結果為臨床操作中創面沖洗劑的選擇提供了參考;研究結果也顯示不可復性牙髓炎經保存活髓治療后,根髓仍存在炎癥表現和一定程度的組織學變性, 表明現有的活髓切斷術對于不可復性牙髓炎的組織并不能使其完全恢復健康。