載硅烷和BMP-2的多孔鈦表面構建及其成骨活性評價

李 為,江崇英,張 雷,孫曉瑜,何 昕,洪 彪,程 楠,李向陽

種植義齒已經成為失牙患者的首選治療方式,其成功的關鍵在于種植體與骨組織形成骨整合(osseointegration)[1]。目前種植體表面改性主要包括:① 形貌改性,通過物理化學手段構建表面超微結構以增加種植體-骨接觸面積,促進成骨細胞黏附和分化而加速骨整合[2];② 表面化學改性,功能分子負載以加速表面礦化、促進骨整合[3];③ 生物分子改性,通過生物化學修飾將特定蛋白[4]或多肽[5]固定在種植體表面,誘導成骨細胞增殖分化以促進骨整合。骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)作為骨基質中的高效骨誘導物質,已經通過涂覆和靜電吸附等方法復合到材料表面,然而其材料結合較弱,容易脫落[6-7],所以尋找共價固定BMP-2的方法意義重大。該研究采用堿熱處理在鈦材表面獲得富羥基的納米孔結構,并進一步通過羥基與硅烷偶聯劑鍵合反應賦予表面Si元素和用于接枝蛋白分子的氨基,最后通過戊二醛將BMP-2共價接枝在硅烷層的氨基上,實現載硅烷和BMP-2的多孔鈦表面成功構建以改善鈦表面的骨整合能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1材料 純鈦購自山西寶雞有色金屬有限公司; 丙酮、戊二醛購自上海國藥集團化學試劑有限公司;二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷、Triton X-100、羅丹明123購自美國Sigma-Aldrich公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;胰酶、牛血清白蛋白、Ⅱ型膠原酶、重組人BMP-2、兔抗BMP-2抗體、生物素標記山羊抗兔IgG、Cy3標記鏈霉親和素購自生工生物工程股份有限公司;DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.1.2儀器 掃描電子顯微鏡購自荷蘭FEI公司;X射線光電子能譜儀(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)購自美國Perkin Elmer公司;接觸角測試儀購自德國Dataphysics公司;酶標儀購自瑞士Tecan公司;熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 樣品制備

1.2.1堿熱處理 將直徑10 mm的鈦片打磨拋光后,依次浸沒于丙酮、無水乙醇、去離子水中分別超聲清洗3次,每次10 min,取出晾干,標記為Ti;將Ti浸沒于60 ℃的NaOH溶液(2.5 mol/L) 24 h,取出鈦片并置于煮沸的去離子水30 min,去離子水超聲清洗3次,每次10 min,取出吹干表面,標記為pTi。

1.2.2硅烷化處理 將pTi置于含1% (W/V) 二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的無水乙醇溶液中,搖床反應10 h,然后取出樣品于120 ℃烘箱中2 h,取出后無水乙醇超聲清洗2次,每次5 min,吹干表面,標記為pTi-S。

1.2.3BMP-2接枝 將pTi-S浸沒于1%的戊二醛水溶液室溫反應1 h,然后超聲清洗去除未反應的戊二醛,將終濃度為0.5 μg/ml的重組人BMP-2工作液50 μl鋪展在樣品表面,室溫反應24 h,去離子水漂洗后吹干,標記為pTi-S-B。

1.3 表面分析表征每組取1個樣品利用XPS檢測表面各元素百分含量;每組取1個樣品通過場發射掃描電子顯微鏡觀察樣品表面形貌;每組取4個樣品(每個樣品選2個位置)利用水接觸角測試儀(WCA)測量表面親水性。每組取1個樣品通過免疫熒光染色觀察表面接枝的BMP-2,步驟如下:①1%的牛血清白蛋白溶液浸泡樣品30 min以封閉非特異性吸附位點;② 取出并吹干表面,滴加20 μl的兔抗BMP-2抗體工作液(稀釋100倍),恒溫箱中37 ℃孵育2 h,PBS漂洗2次,每次2 min;③ 吸干表面液體,加入生物素標記山羊抗兔IgG工作液,繼續37 ℃孵育30 min,PBS漂洗2次;④ 吹干表面液體,滴加Cy3標記鏈霉親和素試劑,37 ℃孵育30 min,PBS漂洗2次,熒光觀察,并通過Image J軟件統計熒光強度。

1.4 細胞相容性評價

1.4.1成骨細胞的獲取 取新生24 h的SPF級雄性SD大鼠經脫頸處死后分離的頭蓋骨,將其剪成2～5 mm2碎片,PBS清洗碎片后采用胰酶消化20 min,離心去上清液后加入Ⅱ型膠原酶消化20 min,收集消化液并采用1 200 r/min離心5 min,收集沉淀后DMEM培養基(20%胎牛血清)重懸并接種于培養皿中,5%CO2和37 ℃下培養2 d,然后改用10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養3 d后換液,待細胞達到80%融合時傳代培養。

1.4.2材料的成骨細胞相容性評價 胰酶消化細胞后,采用DMEM培養基(10%胎牛血清)分散細胞且密度為1×104個/ml,每組取23個樣品置于24孔板中,每孔加入1 ml細胞懸液,5%CO2和37 ℃下繼續培養且隔天換液。在培養至1、3、5 d時,每組取出1個樣品經戊二醛固定1 h后,羅丹明123染液染色15 min,PBS漂洗后再熒光觀察;每組取出4個樣品放入新孔,按照噻唑藍法 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]評價材料對成骨細胞增殖的影響。培養至7 d和14 d時,每組取出4個樣品,PBS清洗2次后吹干表面水分并滴加0.1%Triton X-100溶液50 μl裂解細胞,取30 μl用ALP試劑盒檢測細胞ALP含量。取10 μl按照BCA法蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量。ALP活性最終以U/mg蛋白表示。

2 結果

2.1 樣品表征

2.1.1表面形貌 掃描電子顯微鏡觀察材料表面形貌變化,結果顯示,相較于純鈦(Ti),堿熱處理(pTi)后的鈦表面出現多孔結構,孔徑約為100 nm;硅烷化處理(pTi-S)和BMP-2接枝(pTi-S-B)表面的孔洞被填充、深度變淺,但納米結構依然存在。見圖1。

圖1 各步處理表面的掃描電子顯微鏡照片 ×50 000A:Ti;B:pTi;C:pTi-S;D:pTi-S-B

2.1.2元素分析 X射線光電子能譜全譜檢測分析了材料表面化學元素組成,結果如圖2A所示,硅烷化處理的表面Ti元素的峰幾乎消失,且出現了N和Si的峰,僅有硅烷試劑中存在大量的氨基和硅氧鍵;BMP-2接枝后,Ti2p峰完全消失,Si2P和Si2S峰減弱,不存在硅元素的BMP-2在表面接枝導致XPS檢測深度范圍內Ti消失并且Si含量降低。圖2B、C分別是硅烷化處理表面和BMP-2接枝表面碳元素的高分辨結果,可以看到BMP-2固定后出現-C=O,硅烷試劑中不含C=O鍵,而BMP-2中含有大量的酰胺鍵。

圖2 表面XPS結果A:各表面的XPS全譜圖;B、C:硅烷化處理和BMP-2接枝表面碳1s (C1s)的高分辨譜

2.1.3親水性 單因素方差分析結果顯示,表面親水性與表面結構及元素組成密切相關(F=140.14,P<0.01),純鈦、堿熱處理、硅烷化處理和BMP-2接枝表面的水接觸角分別為(58.3±7.0)°、(14.5±3.4)°、(92.7±8.3)°和(68.4±10.7)°,Turkey檢驗進行兩兩比較發現組間差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.1.4BMP-2熒光檢測 特異性熒光染色可以觀察BMP-2在表面的分布,如圖3所示,硅烷化處理表面未觀察到均勻分布的紅色熒光,只觀察到零星的紅點,BMP-2接枝表面大部分區域分布著紅色熒光;通過Image J軟件測量照片中熒光強度數值,硅烷化處理、BMP-2接枝表面的熒光強度值分別為32 130 和6 850 320,后者是前者的213倍。

圖3 表面BMP-2的免疫熒光檢測A:pTi-S;B:pTi-S-B

2.2 成骨細胞相容性評價

2.2.1細胞黏附與增殖 材料表面成骨細胞相容性分別通過MTT實驗和Rodamine123熒光染色來分析,MTT結果顯示:培養第1天時硅烷化表面的細胞數量高于堿熱處理組(P<0.05);第3天和第5天時,硅烷化表面與堿熱處理表面的細胞數量差異無統計學意義;不同孵育時間BMP-2接枝組表面黏附細胞數量均顯著多于其他兩組,三組的方差分析顯示差異有統計學意義(F=79.678、103.204、6.255,P<0.05)。見圖4、5。

圖4 各表面與細胞孵育第1、3、5天時黏附成骨細胞數量與pTi-S組比較:*P<0.05;與pTi組比較:#P<0.05

圖5 各表面與細胞孵育第1、3、5天時黏附成骨細胞的熒光照片 ×100A、D、G:pTi孵育第1、3、5天時;B、E、H:pTi-S孵育第1、3、5天時;C、F、I:pTi-S-B孵育1、3、5天時

2.2.2細胞成骨能力 各表面所黏附成骨細胞的ALP活性見圖6,培養第7天和第14天時,硅烷化表面ALP活性高于堿活化多孔鈦(P<0.05),BMP-2接枝表面的ALP活性遠高于其它,三組間差異有統計學意義(7 d:F=57.370,P<0.05;14 d:F=109.703,P<0.05)。

圖6 各表面黏附的成骨細胞培養7 d和14 d時的ALP活性與pTi組比較:#P<0.05;與pTi-S組比較:*P<0.05

3 討論

由于具有優異的機械性能、抗腐蝕性能、化學穩定性和生物惰性,鈦及其合金被認為是牙科及骨科等領域的最佳植入金屬材料,但也因生物惰性、高彈性模量等問題導致其骨整合緩慢或應力集中,進而愈合時間長,影響成功率[8]。骨整合指種植體與骨表面直接緊密結合,無任何插入組織,故成骨細胞越早黏附到種植體表面并執行成骨功能,骨整合效果越好。粗糙多孔表面降低材料的彈性模量,且提供更多的細胞“錨定”位點,有利于形成更牢固骨整合,且多孔結構可以在植入體和骨界面之間形成機械鎖合,從而提高骨結合強度[9]。本研究采用堿熱處理,獲得了納米級多孔表面;有研究[2,10]證明多孔結構中,納米孔結構相比微米孔結構更利于成骨細胞的黏附和增殖。另外,多孔結構的表面積顯著增加,可以增加硅烷偶聯劑的連接位點,進而增加其固定量[11]。

硅作為人體必需的微量元素,對骨組織生長過程具有重要影響。有研究證明含硅涂層在機體內有效促進成骨細胞增殖、分化和鈣礦化沉積作用[3]。本研究采用二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷,一端為甲氧基與表面的羥基連接[12],一端為氨基可以用于連接生物活性分子。本研究結果顯示相較于堿熱處理表面,硅烷化表面顯著促進了成骨細胞黏附(培養1 d),但促成骨細胞增殖上未顯示出與堿熱處理表面的顯著差異;其表面ALP表達量顯著增加,證明其具有一定的促成骨分化能力[13]。

大量生物活性分子已經被證明可以有效提升骨修復的速度和質量。BMP家族是確定的促成骨因子,對骨原細胞的分化起決定性作用,也能影響其它細胞的轉分化[14];其中BMP-2是BMP家族成員中作用最強的因子,可以促進ALP表達以增加成骨細胞礦化,也可以通過調控骨代謝以抑制骨吸收和促進骨形成。采用BMP-2直接或者通過其他載體局部應用可促進骨的形成已經過實驗證實[15],但這些物理方式運載BMP-2到骨缺損部位,其在體內容易降解或擴散,無法充分發揮其功能。本研究利用戊二醛連接硅烷試劑上的氨基和BMP-2上的氨基,將BMP-2共價連接到純鈦表面,用以增加鈦表面與成骨細胞的相容性。成骨細胞黏附和增殖結果和ALP含量檢測結果均顯示,該表面不但有利于成骨細胞黏附和增殖,而且可以誘導成骨細胞表達更多的ALP,促進成骨作用。