可溶性CD83促進耐受性DCs和Treg細胞增殖和免疫耐受的分子機制

宋奇鋒,高良輝,李 望,張譯中

由于移植后免疫抑制等方法的改進,肝移植后的存活率逐步提高,并已成為終末期肝病的主要治療方法。肝移植后,需要長期進行免疫抑制,以避免嚴重的急慢性排斥反應和移植物丟失。目前,免疫抑制劑仍主要為鈣調神經磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitors,CNIs),但存在移植后并發癥如腎損傷、新發癌癥、病原體感染等[1-2]。未來需要開發新的針對特定炎癥細胞的選擇性免疫抑制劑。CD83是免疫球蛋白超家族成員,有膜結合或可溶性形式兩種。可溶性CD83(soluble CD83,sCD83)具有免疫抑制功能[3-5]。抗CD83特異性抗體在移植物抗宿主病(graft-vs-host disease,GVHD)的臨床前模型中顯示出良好的功效,且不會影響病毒或腫瘤特異性記憶T細胞的反應[6]。但二者具體的作用方式和機制仍不清楚。該研究擬探討sCD83對未成熟樹突細胞(dendritic cells,DCs)和調節性T(regulatory T,Treg)細胞數量和比例的影響,以及其發揮免疫抑制的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 2只6～8周齡C57B/6小鼠,體質量(22±3)g,購自海南省藥物研究所有限責任公司;實驗動物生產許可證號:SCXK(瓊)2020-0007。小鼠飼養于恒溫(23±2)℃、恒濕、12 h/12 h光/暗循環的標準SPF級鼠房,飼喂嚙齒類動物標準飼料,自由進食和飲水。

1.1.2試劑與儀器 sCD83(貨號:SRP6207)、重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)(貨號:SRP3201)、重組小鼠白細胞介素(interleukin,IL)-4(貨號:SRP3211)、蛋白酶抑制劑混合物(P8465)購自美國Sigma-Aldrich公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(貨號:16140071)、RPMI-1640(貨號:31800022)購自美國Thermo Fisher公司;細胞核蛋白提取試劑盒(P1202-50)購自北京普利萊生物有限公司;Alexa fluor 488標記的兔抗小鼠CD40(貨號:ab302971)、CD86(貨號:ab290990)、CD83(貨號:ab286828)、Ⅱ類主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex class Ⅱ,MHC Ⅱ)(貨號:ab203323)、Alexa fluor 488標記的兔IgG單抗(貨號:ab199091)、FITC標記的抗CD4單克隆抗體(貨號:ab59474)、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記的抗CD25單克隆抗體(貨號:ab210335)、抗FOXP3單克隆抗體(貨號:ab218773)以及兔抗小鼠-磷酸酶和張力蛋白同源物單抗(phosphatase and tensin homolog,PTEN)(貨號:ab267787)、兔抗小鼠蛋白激酶B單抗(protein kinase B,Akt)(貨號:ab283852)、兔抗小鼠磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B,p-Akt)單抗(Thr 308)(貨號:ab8933),兔抗小鼠核因子κB亞基RelB單抗(貨號:ab33907),兔抗小鼠程序性細胞死亡蛋白-1(programmed cell death 1,PD-1)單抗(貨號:ab52587)購自美國Abcam公司;淋巴細胞分離液(貨號:70-HLSM1077)購自杭州聯科生物公司;CD4+T細胞分離試劑盒(貨號:130-091-301),抗FITC MicroBeads(貨號:130-048-701),抗PE MicroBeads(貨號:DXT-130-097-054),LS+磁珠分選柱(貨號:130-042-401),MiniMACS Starting Kit(貨號:130-090-312)購自德國Miltenyi Biotec公司;小鼠IL-10(貨號:ml037888)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)(貨號:ml057830)、IL-12(貨號:ml037881)和犬尿酸(貨號:ml042437)ELISA試劑盒購自上海酶聯生物有限公司;流式細胞儀(型號:Calibur)購自美國BD公司;酶標儀(型號:Synergy H4)購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1體外細胞實驗分組和處理方法 體外細胞實驗分為2組:Control組,向細胞培養物中加入10 μl PBS處理;sCD83組:向細胞培養物中加入10 μl 10 μg/ml的可溶性CD83(溶解于PBS緩沖液)處理[7]。

1.2.2DCs的分離和培養 從C57B/6小鼠骨髓祖細胞培養骨髓衍生的DCs。實驗方法為:通過CO2窒息法安樂死小鼠,分離其股骨和脛骨,使用冰預冷的PBS緩沖液將其中的骨髓沖洗下來,置于10 ml離心管中,于4 ℃以220 r/min離心10 min,收獲細胞沉淀。使用補充有15% FBS的RPMI-1640培養液重懸細胞沉淀并轉移至6孔板中,添加含有100 U/ml青鏈霉素的RPMI-1640+15%FBS培養液,并加入終濃度均為10 ng/ml的重組小鼠GM-CSF和重組小鼠IL-4,置細胞于37 ℃恒溫濕潤的CO2細胞培養箱中對其進行培養。次日去除非貼壁細胞并更換為新鮮的含有終濃度均為20 ng/ml重組GM-CSF和10 ng/ml重組小鼠IL-4的RPMI-1640+15%FBS培養液繼續培養。每隔1 d更換1次新鮮培養液,3 d后開始收獲松散貼壁的聚集增殖的DCs[7]。

1.2.3流式細胞術測定DCs表面標志物 DCs用Alexa fluor 488-標記的兔抗小鼠CD40、CD86、CD83、MHC Ⅱ單克隆抗體進行染色,Alexa fluor 488標記的兔IgG單抗作為Isotype control。然后使用Calibur流式細胞儀對表達對應表面標志物的細胞進行計數。

1.2.4Treg細胞的分離和流式細胞術分選 通過CO2窒息法安樂死小鼠,取小鼠脾臟,放入盛有Hank′s溶液的細胞培養皿中。使用組織研磨棒在200目的尼龍篩網上旋轉擠壓脾臟,使組織內的細胞通過篩網。然后去掉尼龍篩網,將細胞懸液收集至一個15 ml離心管中,于4 ℃以2 000 r/min離心5 min,棄上清液。向細胞沉淀中加入5 ml紅細胞裂解液,充分重懸細胞沉淀,于室溫孵育2 min,于4 ℃以2 000 r/min離心5 min,棄上清液。加入冰預冷的Hank′s溶液再次重懸細胞沉淀,加入淋巴細胞分離液,離心使細胞分層,吸取血漿和淋巴細胞分離液之間的單核細胞層,其中含有淋巴細胞和單核細胞。加入等體積Hank′s溶液稀釋單核細胞層,室溫以800 r/min離心10 min,保留細胞沉淀,棄上清液。再次加入Hank′s溶液重懸細胞沉淀。使用CD4+T細胞分離試劑盒純化CD4+CD25-和CD4+CD25+T細胞,即Treg細胞。將細胞重懸于含牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS緩沖液(pH 7.2,另含0.5%BSA和2 mmol/L EDTA)中。淋巴細胞用FITC-標記的抗-CD4單抗和抗-FITC MicroBeads標記,然后在LS+磁珠分選柱上純化。然后CD4+T細胞與MiniMACS Starting Kit中的釋放試劑共同孵育,去除結合的微珠。使用PE標記的抗CD25單抗和抗PE MicroBeads分選CD4+CD25+T細胞。通過流式細胞術使用PE-標記的抗-FOXP3單抗分析T細胞,分選并計數CD4+CD25+FOXP3+T細胞,即Treg細胞。

1.2.5Treg細胞核和胞質蛋白提取 使用細胞核蛋白提取試劑盒提取Treg細胞核蛋白。收集分選獲得的Treg細胞,每次提取(1～2)×107個細胞/樣品。在4 ℃下以880 r/min離心細胞5 min。加入1 ml冰預冷的試劑盒自帶的Buffer-1,振蕩重懸細胞,冰水浴孵育5 min。加入50 μl試劑盒自帶的Reagent-A試劑,劇烈振蕩混合,冰水浴孵育5 min。然后再次劇烈振蕩。使用22號針頭反復多次抽吸細胞裂解物,利用剪切力充分裂解細胞。在光學相差顯微鏡下觀察未裂解細胞應少于5%,然后進行下一步。將制備好的細胞勻漿物轉移至一個新的EP管中,在4 ℃下以1 100 r/min離心細胞3 min,然后再在4 ℃下沉淀細胞核;上清液為細胞質溶液,轉移至一個新EP管中,備用。加入0.5 ml試劑盒自帶的Buffer-2重懸細胞核。在4 ℃下以2 200 r/min離心細胞10 min,洗細胞核。重復洗細胞核1次。在光學相差顯微鏡下觀察細胞核應游離分散于清亮背景下,而無顆粒物質(此為細胞質成分殘留)。棄上清液,用100 μl試劑盒自帶的緩沖液重懸細胞核,進行下游細胞核總蛋白的提取。使用RIPA裂解液分別裂解細胞質和細胞核提取物,隨后按照標準操作分別提取其總蛋白質即可。

1.2.6混合淋巴細胞反應 將來源于小鼠骨髓的原代同種異體骨髓衍生DCs與分離獲得的CD4+T細胞按照DC ∶T細胞=1 ∶5的比例進行混合,置于6孔板中共培養。向混合細胞中添加RPMI-1640+10% FBS的完全培養液,連續共培養3 d,收集細胞培養物上清液,進行下游ELISA測定。

1.2.7ELISA測試 按照試劑盒說明書給出的操作指南,使用小鼠IL-10、TGF-β、IL-12和犬尿酸ELISA試劑盒對細胞上清液中的相應項目成分進行測定。使用酶標儀進行檢測。

1.2.8Western blot檢查 使用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)對細胞進行裂解,提取其總蛋白質。室溫下使用含10%脫脂奶粉的TBS緩沖液對PVDF膜進行封閉1 h。隨后向PVDF膜上滴加一抗工作液,于4 ℃共同孵育過夜。次日向PVDF膜上滴加二抗工作液,于室溫共同孵育1 h。抗體工作濃度如下:PTEN(稀釋度1 ∶1 500),p-Akt(Thr 308)(稀釋度1 ∶1 000),Akt(稀釋度1 ∶1 500),細胞核RelB(稀釋度1 ∶2 000)、細胞質RelB(稀釋度1 ∶1 500)、PD-1(稀釋度1 ∶1 000)。使用ECL化學發光底物對目的條帶進行顯影。

2 結果

2.1 sCD83促進未成熟DCs(immature DCs,imDCs)增殖并上調吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的表達與Control組相比,sCD83組表達表面標志物CD40、CD83、CD86、MHC Ⅱ的DCs細胞計數降低(P<0.05),見圖1A、B。Western blot結果顯示,分選獲得的低表達CD40、CD83、CD86、MHC Ⅱ的imDCs胞內IDO的表達水平升高(P<0.05),見圖1C、D。ELISA結果顯示,與Control組相比,sCD83組DCs細胞培養上清液中犬尿酸的水平升高(t=11.12,P<0.05),見圖1E。

2.2 sCD83促進Treg細胞增殖并調節PTEN/Akt通路流式細胞術結果顯示,與Control組相比,sCD83組CD4+CD25+FOXP3+T細胞,即Treg細胞計數升高(P<0.05),見圖2A、B;Western blot結果顯示,與Control組相比,分選獲得的Treg細胞內PTEN的表達水平升高(P<0.05),p-Akt (Thr 308)的表達水平降低(P<0.05),Akt的表達水平無明顯變化,見圖2C、D。

圖2 體外培養CD4+ T細胞中Treg細胞的定向分化情況測定A、B:流式細胞術測定體外培養CD4+ T細胞中Treg細胞的定向分化情況結果圖和統計結果柱狀圖;C、D:Western blot測定分選獲得的Treg胞內PTEN、p-Akt和Akt蛋白質的表達水平結果圖和統計結果柱狀圖;a:Control組;b:sCD83組;與Control組比較:*P<0.05

2.3 sCD83抑制Treg細胞核內RelB并下調PD-1的表達Western blot結果顯示,分選獲得的Treg細胞核內RelB的表達水平降低(P<0.05),胞質RelB的表達水平升高(P<0.05),PD-1的表達水平降低(P<0.05)。見圖3A、B。

圖3 Treg細胞中RelB和PD-1的表達情況測定A、B:Western blot測定分選獲得的Treg細胞核內、胞質內RelB和PD-1的表達情況結果圖和柱狀圖統計結果;a:Control組;b:sCD83組;與Control組比較:*P<0.05

2.4 sCD83對imDCs與Treg細胞共培養物中免疫抑制因子的表達水平的影響用ELISA測定imDCs與CD4+T細胞共培養物上清液中IL-10、TGF-β和IL-12的水平,與Control組相比,sCD83組IL-10和TGF-β的水平升高(P<0.05),IL-12的水平降低(P<0.05)。見圖4。

3 討論

DCs是高度特化且功能多樣的抗原呈遞細胞(APCs),負責控制先天性和適應性免疫反應。DCs起源于骨髓祖細胞,可通過不同刺激分化為免疫反應性或免疫耐受性DCs。在器官移植中,DCs在決定移植器官的命運方面發揮著至關重要的作用:宿主對移植器官的排斥或接受,取決于DCs的免疫耐受性或免疫反應性功能[8]。研究[8]顯示,免疫耐受性DCs與同種異體移植物的存活率呈正相關,在非人靈長類動物的各種器官移植模型中,免疫耐受性DCs能夠延長同種異體移植物的存活率。已有研究[9]顯示,通過調節細胞表面分子防止DCs成熟可維持DCs的免疫耐受性,imDCs在維持免疫耐受中十分關鍵。與成熟DCs相比,imDCs表面標志物CD40、CD83、CD86和MHC Ⅱ表達下調。本研究結果顯示,與Control組相比,sCD83處理后表達表面標志物CD40、CD83、CD86、MHC Ⅱ的DCs細胞計數所占百分比降低,表明在DCs細胞群內,有更多的imDCs,進而可能會介導維持機體的免疫耐受狀態。

Treg細胞是CD4+CD25+FOXP3+T細胞,在人和小鼠中來源于胸腺和外周CD4+T細胞。Treg細胞在維持宿主免疫耐受方面也發揮重要功能。Treg細胞可以通過釋放TGF-β和IL-10,下調IL-12的表達使DCs保持未成熟狀態[10]。轉錄因子RelB是核因子-κB家族成員,在介導免疫反應中起關鍵作用。在細胞水平上,RelB表達主要限于DCs、T細胞、B細胞和單核細胞中。當其轉位至細胞核中,RelB作為核因子-κB轉錄因子的組分發揮促進DCs成熟的功能;而胞質內RelB為無活性狀態[11]。與髓源性DCs成熟相關的表面標志物,如MHC Ⅱ、CD80、CD86和CD40,在RelB缺陷型小鼠中表達減少[12]。本研究結果顯示,與Control組相比,sCD83處理后imDCs與CD4+T細胞共培養物上清液中IL-10和TGF-β的水平升高,IL-12的水平降低,且sCD83能夠下調CD4+T細胞核內RelB的水平。說明sCD83可能通過調節CD4+T細胞核內RelB的水平,調控相關細胞因子的表達,從而促進imDCs與Treg細胞協同作用,增強兩種細胞發揮免疫耐受活性的功能。

IDO是免疫調節因子,并且與色氨酸代謝相關。IDO可促進色氨酸分解為犬尿酸并調節Treg細胞的分化,以維持T細胞的免疫耐受性[13]。與此同時,微環境中的犬尿酸水平升高也能通過正反饋回路促進IDO的上調表達。干擾素-γ可通過激活Toll-樣受體3(TLR3)-依賴的IDO/犬尿酸通路增強犬骨髓間充質干細胞的免疫耐受能力[14]。本研究中也顯示,sCD83處理后,imDCs胞內IDO的表達水平上調,并促進了DCs細胞群培養物上清液中犬尿酸的水平。說明sCD83也能通過調節IDO和犬尿酸的水平對DCs發揮免疫抑制功能。

最近的報道[15]顯示,在體實驗中PD-1調節Treg細胞的免疫抑制功能,PD-1表達缺陷后Treg細胞的免疫抑制功能得以發揮,從而改善了實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠和糖尿病小鼠的疾病進展,說明了PD-1表達缺陷對于強效發揮Treg細胞免疫抑制功能的體內意義。本研究結果也支持這一研究結論,與Control組相比,sCD83處理后下調了PD-1的表達水平。小鼠Treg細胞中PTEN基因缺失會破壞Treg細胞的免疫耐受性表型的穩定性,這會阻止移植物或腫瘤在其微環境中形成免疫耐受[16]。p-Akt抑制Treg細胞的發育[17]。相對高水平的Treg細胞對于宿主免疫耐受十分重要,而本次研究結果表明,sCD83能夠通過下調核內RelB的水平、上調PTEN,抑制PD-1和Akt,促進CD4+T細胞向Treg細胞的分化,維持免疫耐受狀態。

基于以上研究,推斷sCD83的免疫抑制活性,很可能是通過調節CD4+T細胞核內RelB的水平,促進其向Treg細胞方向分化,調節細胞因子IL-10、TGF-β和IL-12的分泌,影響DCs和Treg細胞的細胞間通訊,并影響IDO和PD-1的表達和PTEN/Akt通路的活性,以進一步維持免疫耐受狀態所需要的imDCs和Treg細胞的細胞數量和比例。即sCD83能夠通過抑制Treg細胞核內RelB的水平調節相關細胞因子的分泌影響DCs和Treg細胞的細胞間通訊,促進耐受性imDCs和Treg細胞的增殖。然而,該研究未深入探索sCD83調節核內RelB的水平的具體分子機制,這是進一步要研究的內容。