HCAR2介導低氧促K562細胞向紅系分化作用

陳 迎,李 建,曹 炎,何云凌,吳麗穎,周鋼橋

羥基羧酸受體2(hydroxy-carboxylic acid receptor 2,HCAR2)是一種Ⅱ型羥基羧酸受體,多在脂肪細胞中表達,并發揮抗脂解的作用[1]。低氧會上調人原代單核細胞和巨噬細胞中HCAR2的表達[2]。但是,低氧是否影響K562細胞中HCAR2的表達,以及HCAR2在K562細胞中發揮的作用目前尚不清楚。

人慢性髓系白血病K562細胞是一種紅細胞和巨核細胞譜系高度未分化的祖細胞[3],具有分化為紅系細胞和巨核細胞的潛力[4],有報道指出,低氧能夠加速K562向紅系分化的進程[5]。由于在hemin刺激下[6]K562細胞會產生胚胎型和胎兒型血紅蛋白,這一特性為人類紅系分化相關研究提供了一種理想的細胞模型。因此,該研究以K562細胞作為紅系分化研究的體外模型,探究HCAR2對K562細胞向紅系分化的影響,為揭示紅系發育相關疾病的致病機制及研發相關診療藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞和載體 人慢性髓系白血病細胞K562受贈于軍事醫學研究院王華副研究員,HEK293T細胞保存于輻射醫學研究所遺傳學與整合組學實驗室細胞庫;pCDH-control-puro、pCDH-HCAR2-puro、pLVX-control-Puro、pLVX-HCAR2-puro均購于長沙優寶生物科技有限公司;包裝質粒psPAX2和pMD2.G儲存于輻射醫學研究所遺傳學與整合組學實驗室。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI-1640培養基、FITC-CD71抗體購自美國Thermo Fisher Scientific公司;全細胞裂解液RIPA、山羊抗小鼠/兔二抗購自北京康為世紀生物科技有限公司;脫脂奶粉、APC-CD235a抗體購自美國BD Biosciences公司;逆轉錄試劑盒購自武漢莫納生物科技有限公司;HM74抗體購自美國Bioword Technology Inc公司;β-actin抗體、CD235a抗體購自武漢Abclonal公司;γ-globin抗體購自美國Santa Cruz公司;hemin購自美國Sigma Aldrich公司;蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司;一抗稀釋液、ZLip2000轉染試劑購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;SYBR Green熒光定量試劑盒購自美國Kapa Biosystems公司;二氧化碳培養箱(型號:FormaTM)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;顯微鏡(型號:ECLIPSE Ti2)購自日本Nikon公司;流式細胞儀(型號:FACSAriaTMIII)購自美國BD公司;熒光定量PCR儀(型號:QuantStudioTM3)購自美國Applied Biosystems公司;SDS-PAGE電泳儀、電轉儀購自美國Bio-Rad公司;全自動化學發光圖像分析系統(型號:5200)購自上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及向紅系誘導分化 將K562細胞置于補充有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養基中,并在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。將K562細胞按照3×105/ml的密度鋪于60 mm培養皿中,根據課題組前期篩選的最適藥物終濃度(30 μmol/L),加入hemin誘導向紅系分化。

1.2.2低氧處理條件 將K562細胞(3×105/ml)平均分為兩組分別置于低氧(3% O2)和常氧(20% O2)培養箱中培養1、2、3 d;敲低和過表達的細胞株以相同密度鋪板,分組標記,分別在常氧和低氧培養箱中培養2 d。

1.2.3慢病毒包裝 利用HIV病毒將自身基因組插入整合到宿主基因組的特性,向HEK293T細胞轉入psPAX2、pMD2.G和目的質粒。HEK293T接種于100 mm培養皿,待細胞密度達到70%～80%,按ZLip2000轉染試劑說明書進行轉染,目的質粒、psPAX2、pMAD2.G以3 ∶2 ∶1的比例添加。于轉染后48 h回收含有病毒的培養基,用病毒濃縮液濃縮離心后分裝,-80 ℃保存備用。

1.2.4HCAR2敲低、過表達穩轉株的構建 用濃縮后的病毒液感染K562細胞,同時加入10 μg/ml的聚凝胺(Polybrene)以促進病毒進入細胞。感染48 h后,利用嘌呤霉素抗性進行藥物篩選,之后通過檢測HCAR2的mRNA和蛋白表達水平來鑒定敲低、過表達穩轉株是否構建成功。shRNA序列見表1。

表1 shRNA靶向序列

1.2.5聯苯胺染色觀察紅細胞生成比例 收取分化后的K562細胞,用PBS重懸細胞,將細胞密度調整為1×105個/ml,取100 μl細胞懸液與5 μl聯苯胺工作液(配方:25 μl 聯苯胺染液+25 μl H2O+1 μl H2O2)混勻,加入96孔板,室溫避光反應5 min。最后在光學顯微鏡下進行觀察拍照,每組至少隨機選取5個視野,用以計算聯苯胺陽性細胞比例。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達水平 收取細胞,離心后加入全細胞裂解液RIPA吹打均勻,4 ℃裂解30 min,12 000 r/min離心10 min后吸取上清液,加4×上樣緩沖液煮沸10 min,-20 ℃凍存備用。根據目的蛋白分子量選用合適濃度的丙烯酰胺凝膠,上樣、電泳、轉膜,經5%脫脂奶粉封閉1 h、一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h,最后在凝膠成像儀中顯影。

1.2.7實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA水平 收集細胞,提取細胞總RNA,測定RNA樣品濃度并進行逆轉錄。RT-qPCR反應體系在96孔板中充分混勻,置于RT-qPCR儀上進行反應,每組設3個復孔,以β-actin為內參進行定量分析。RT-qPCR引物序列見表2。

表2 RT-qPCR的引物序列

1.2.8流式細胞術 收取經處理后的各組細胞,每組細胞量不少于1×105個,用100 μl PBS溶液重懸細胞,加入CD235a抗體和CD71抗體,室溫下避光孵育15 min,之后PBS洗3次,重懸于300 μl PBS中,混合均勻后用流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 低氧對K562細胞向紅系分化的影響聯苯胺染色結果顯示,無論在常氧還是低氧條件下,聯苯胺陽性細胞比例均隨分化時間逐漸升高;且與常氧組相比,低氧組聯苯胺染色陽性細胞比例更高(F=175.9,P<0.05)(圖1A、B)。RT-qPCR和Western blot實驗分別檢測了紅系細胞特異性分子CD235a和γ-globin的蛋白及mRNA表達水平,相較于常氧組,低氧組CD235a和γ-globin的表達增加(FCD235a=127.0,Fγ-globin=158.1,P<0.05)(圖1C～E)。流式細胞術檢測CD71和CD235a的表達情況,結果顯示在分化的不同時間點,低氧組CD71+/CD235a+細胞的百分比均高于常氧組(F=85.8,P<0.01)(圖1F、G)。

圖1 低氧對K562細胞向紅系分化的影響A、B:聯苯胺染色觀察K562細胞紅系分化情況及其統計直方圖 ×200;C:Western blot實驗檢測CD235a及γ-globin的蛋白表達變化;N:常氧組;H:低氧組;D、E:RT-qPCR檢測CD235a及γ-globin的mRNA水平;F、G:流式細胞術檢測CD71+/CD235a+細胞百分比及其統計直方圖;與常氧組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.2 HCAR2與紅系分化的相關性根據Western blot和RT-qPCR實驗結果,低氧組HCAR2蛋白和mRNA的表達均高于常氧組(F=110.0,P<0.05)(圖2A、B);與此同時,CD235a和γ-globin在低氧下的蛋白表達上調,變化趨勢與HCAR2相似(圖2A)。因此,采用pearson法進一步分析,發現K562細胞向紅系分化過程中HCAR2分別與CD235a(r=0.631 1,P=0.006 6)和γ-globin(r=0.814 1,P<0.000 1)的mRNA水平呈正相關(圖2C、D)。

圖2 HCAR2與紅系分化的相關性A:Western blot實驗檢測HCAR2、CD235a及γ-globin的蛋白表達變化;N:常氧組;H:低氧組;B:RT-qPCR檢測HCAR2的mRNA水平;C:HCAR2與CD235a 表達的相關性散點圖;D:HCAR2與γ-globin表達的相關性散點圖;與常氧組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 敲低HCAR2對低氧促紅系分化的影響為了進一步探討HCAR2對紅系分化的影響,通過慢病毒感染構建了穩定敲低HCAR2的K562細胞株,用來研究HCAR2低表達對K562細胞向紅系分化的影響。Western blot和RT-qPCR實驗分別檢測了敲低HCAR2后,K562細胞向紅系分化時CD235a和γ-globin蛋白和mRNA的表達變化。結果顯示,敲低HCAR2后,無論常氧組還是低氧組CD235a和γ-globin蛋白的表達均下調(圖3A),CD235a和γ-globin的mRNA水平均降低(FCD235a=129.4,Fγ-globin=30.02,P<0.05)(圖3B、C)。隨后通過聯苯胺染色觀察顯示,在常氧和低氧下敲低HCAR2均會使得聯苯胺陽性細胞比例降低(F=31.86,P<0.05)(圖3D、E)。流式細胞術檢測結果顯示敲低HCAR2后常氧組和低氧組中CD71+/CD235a+細胞百分比均有所減小(F=118.2,P<0.001)(圖3F、G)。

圖3 敲低HCAR2對低氧促紅系分化的影響A:Western blot實驗檢測HCAR2、CD235a及γ-globin的蛋白表達變化;B、C:RT-qPCR檢測CD235a和γ-globin的mRNA水平;D、E:聯苯胺染色觀察K562細胞紅系分化情況及其統計直方圖 ×200;F、G:流式細胞術檢測CD71+/CD235a+細胞百分比及其統計直方圖;a:shCtrl組;b:shHCAR2組;與shCtrl組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與常氧組比較:#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001

2.4 HCAR2過表達對低氧促紅系分化的影響Western blot實驗結果顯示常氧和低氧條件下過表達HCAR2后CD235a和γ-globin的蛋白表達上調(圖4A),RT-qPCR實驗結果顯示HCAR2高表達時,CD235a和γ-globin的mRNA水平升高(FCD235a=67.04,Fγ-globin=81.74,P<0.05)(圖4B、C)。聯苯胺染色觀察到過表達HCAR2后,常氧組和低氧組K562細胞中聯苯胺陽性細胞比例均升高(F=52.99,P<0.01)(圖4D、E)。流式細胞術檢測結果顯示,過表達HCAR2后CD71+/CD235a+細胞的百分比增加(F=53.37,P<0.05)(圖4F、G)。

圖4 HCAR2過表達對低氧促紅系分化的影響A:Western blot實驗檢測HCAR2、CD235a及γ-globin的蛋白表達變化;B、C:RT-qPCR檢測CD235a和γ-globin的mRNA水平;D、E:聯苯胺染色觀察K562細胞紅系分化情況及其統計直方圖 ×200;F、G:流式細胞術檢測CD71+/CD235a+細胞百分比及其統計直方圖;a:Vector組;b:HCAR2組;與Vector組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與常氧組比較:##P<0.01,###P<0.001

3 討論

研究表明低氧可促進紅系分化,Cao et al[7]發現K562細胞中缺氧誘導因子-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1)與TET3蛋白結合的位點缺失會抑制低氧條件下的紅系分化,并使得細胞活力顯著下降,這表明HIF-1可能介導了低氧促紅系分化作用。之前的研究[8]進一步證實了HIF-1通過上調其靶基因REDD1來抑制mTORC1信號通路并增強自噬水平,從而促進了低氧下的紅系分化進程。而本研究通過在常氧和低氧條件下分別誘導K562細胞向紅系分化,觀察到低氧具有促進K562細胞向紅系分化的作用;在K562細胞向紅系分化過程中HCAR2表達升高并受低氧調控。因此,推測HCAR2可能作為一個新的低氧靶分子參與調控紅系分化過程。

本研究通過構建穩定敲低HCAR2的K562細胞株發現HCAR2的低表達能抑制K562細胞向紅系分化,減弱低氧促紅系分化的作用;同時,通過過表達HCAR2細胞株的構建,進一步證明了HCAR2的高表達更有利于紅系分化,并且能夠增強低氧對紅系分化的促進作用。這些結果提示HCAR2參與介導了低氧對紅系分化的促進作用。HCAR2是一種G蛋白偶聯受體,與抑制型G蛋白(Gi)相連[9],可通過抑制腺苷酸環化酶的活性,降低細胞中環磷酸腺苷的水平[10]。有學者發現在紅系分化過程中細胞內環磷酸腺苷水平呈持續性下降[11],因此,HCAR2可能是通過抑制腺苷酸環化酶活性降低細胞內環磷酸腺苷水平,從而介導低氧促K562細胞向紅系分化的作用,但其中涉及的具體分子機制還有待研究。

本研究闡述了HCAR2自身表達水平的變化對紅系分化的影響,然而HCAR2作為一種細胞膜受體,其功能的發揮也可以通過結合不同配體實現。例如,在腸上皮細胞中,通過識別β-羥基丁酸(BHB)誘導轉錄因子HOPX的表達,進而抑制細胞增殖,減慢腸道腫瘤的生長速度[12];而在動脈粥樣硬化小鼠模型中,口服3-羥基丁酸可通過激活HCAR2促進巨噬細胞中的膽固醇外流,顯著改善動脈粥樣硬化[13]。但HCAR2對紅系分化的調控中是否有某種配體的參與尚不清楚。

綜上所述,該研究表明HCAR2在低氧刺激下表達升高,并可以促進K562細胞向紅系分化,這為認識和探索HCAR2的新功能提供了參考。然而,低氧促HCAR2高表達的過程是否有HIF-1的參與,以及HCAR2配體刺激能否促進K562細胞向紅系分化,還需要進一步實驗驗證。