低氧/冷暴露對肥胖大鼠模型白色脂肪棕色化的影響

郜 琨,楊歷新,王 葉,許海琦

目前,肥胖是影響人類健康的重大問題,其成為了危害身體健康的頭號殺手[1]。肥胖已經取代了營養不良和感染的疾病影響,與一些疾病如糖尿病[2]都有明顯的相關關系。如何減控體質量已成為目前研究的熱點及難點。低氧環境下的體質量減輕是近年發現的一個新的生理現象,國內外有包括長期慢性低氧和短期低氧暴露情況下關于體質量的各種觀察研究。研究[3]表明,冷暴露不僅能提高棕色脂肪活性,還能高度選擇性地刺激皮下脂肪解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1,UCP-1)的表達和產熱活性。還有研究[4]指出,低氧暴露可以降低體脂,冷暴露可誘導白色脂肪棕色化和棕色脂肪組織分化,但有關低氧、冷暴露后白色脂肪棕色化的生物學機制尚不完全清楚。本研究通過白色脂肪棕色化對傳統調控機制PPAR-γ2、PRDM16和UCP-1表達和活性的增強效應,探究低氧/冷暴露對肥胖大鼠白色脂肪棕色化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料60只雄性SD大鼠購于南京君科生物公司,生產許可證號:SCXK(蘇)2018-0001,將所有大鼠放在SPF級動物房中飼養,均自由攝食及飲水,每12 h光照/12 h黑暗,溫度為19～25 ℃,濕度為45%～55%。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組 60只大鼠通過高脂喂食構建肥胖大鼠模型。6周后超過普通飼料飼養大鼠平均體質量10%為肥胖造模成功。有40只大鼠建模成功,將其隨機分為對照組、低氧組、低溫組、低氧低溫組,每組10只。其中對照組大鼠模型放置在正常環境中(氧濃度21%,實驗溫度>4 ℃),低氧組大鼠放置在低氧常溫環境下(氧氣含量為16.2%,實驗溫度>4 ℃),低溫組大鼠放置在冷環境中(氧氣含量為21%,實驗溫度0 ℃±4 ℃),低氧低溫組大鼠大鼠放置在低氧/冷環境中(氧氣含量為16.2%,實驗溫度0 ℃±4 ℃)。所有大鼠在實驗期間均普通飼料飼養。

1.2.2測量大鼠體質量及體脂 觀察4組大鼠精神狀態、活動情況、每周測量體質量。4周時利用美國Columbus實驗動物代謝和Echo Medical Systems體成分分析儀測量分析系統分別檢測4組大鼠代謝率和體脂含量,隨后大鼠禁食18 h后經乙醚麻醉后稱體質量,眼球放血5 ml留取血清和分離腎周白色脂肪和肩胛棕色脂肪。各組小鼠血清樣本通過4 ℃離心后-20 ℃保存。

1.2.3蘇木精-伊紅(HE)染色檢測大鼠脂肪組織形態變化 新鮮的大鼠腎周白色脂肪和肩胛棕色脂肪固定于10%的甲醛溶液,固定時間約24 h。梯度乙醇脫水從80%乙醇、95%乙醇至無水乙醇約為4 h,組織透明后浸蠟,隨后以石蠟包埋和切片厚度一般為5 μm,常規HE染色。染色理想的切片在顯微鏡下應是細胞核與細胞質藍紅相映,色澤鮮艷,核質對比明顯,核膜及核染色質顆粒清晰可見。最后利用日本Keyence顯微鏡進行觀察分析。

1.2.4免疫熒光法檢測蛋白表達 新鮮的大鼠腎周白色脂肪和肩胛棕色脂肪經常規脫蠟水化后置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡,每次10 min。采用PBS沖洗3次,每次5 min,然后加入驢血清置于室溫下封閉1 h,棄驢血清并加入一抗于4 ℃環境下孵育過夜;取出加二抗于室溫下孵育2 h,經PBS沖洗后采用蒸餾水沖洗3次,每次5 min,加入含DAPI的抗淬滅封片劑,置于室溫下避光反應5 min,封片然后置于顯微鏡下觀察。

1.2.5熒光定量PCR檢測基因的表達 利用TRIzol試劑分別從大鼠肩胛棕色脂肪及腎周白色脂肪中提取總RNA。每個循環94 ℃,變性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s。觀察過氧化物酶體增殖劑激活受體γ2(PPAR-γ2)、PRDM16 和解偶聯蛋白(UCP-1)基因的表達量,18s核糖體RNA(18S)作為參照。

1.2.6Western blot檢測脂肪蛋白表達 利用BCA蛋白試劑盒分別從大鼠肩胛棕色脂肪及腎周白色脂肪中提取總蛋白,分別取各組總蛋白30 μg,蛋白樣品用SDS-PAGE膠進行電泳,濕法將蛋白質從凝膠轉移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉在室溫的條件下封閉1 h,按照說明書的方法加入一抗(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜后加入二抗lgG(1 ∶3 000),室溫條件下孵育1 h,顯色顯影,以β-actin蛋白為內參計算UCP-1蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 大鼠體質量、體脂比較與對照組相比,低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠體質量、體脂率均下降(P<0.05);與低溫低氧組相比,低氧組、低溫組大鼠體質量、體脂率均升高(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠體質量、體脂

2.2 大鼠脂肪組織HE染色細胞形態及脂肪細胞面積比較對照組大鼠脂肪組織內脂肪細胞面積較大呈不規則形狀,可見大型脂滴;低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠脂肪組織內脂肪細胞面積減小且數量增多,其中低溫低氧組細胞形態變化最為明顯。另外,在低溫低氧組大鼠腎周白色脂肪組織細胞可見有棕色化的趨勢,見圖1～3。

圖1 各組大鼠肩胛棕色脂肪組織細胞形態 HE染色 ×200A:對照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組

圖2 各組大鼠腎周白色脂肪組織細胞形態 HE染色 ×200A:對照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組

圖3 各組大鼠脂肪面積比較A:對照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;與對照組比較:*P<0.05;與低溫低氧組比較:#P<0.05

2.3 大鼠脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達與對照組相比,低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠肩胛棕色脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達均升高(F=378.495、102.061、322.443,P<0.05),腎周白色脂肪組織PPAR-γ2基因表達降低(F=4.555,P<0.05)、PRDM16、UCP-1基因表達均升高(F=24.387、163.660,P<0.05)。與低溫低氧組相比,低氧組、低溫組大鼠肩胛棕色脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達均更低;低氧組、低溫組大鼠腎周白色組織PPAR-γ2基因表達更高,PRDM16、UCP-1基因表達更低(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 大鼠肩胛棕色脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達A:對照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;與對照組比較:*P<0.05;與低溫低氧組比較:#P<0.05

圖5 大鼠腎周白色脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達A:對照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;與對照組比較:*P<0.05;與低溫低氧組比較:#P<0.05

2.4 大鼠脂肪組織UCP-1蛋白表達與對照組相比,低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠肩胛棕色脂肪組織與腎周白色脂肪組織UCP-1蛋白表達均升高(P<0.05);與低溫低氧組相比,低氧組、低溫組大鼠肩胛棕色脂肪組織與腎周白色脂肪組織UCP-1蛋白表達均降低(P<0.05),見圖6～10。

圖6 大鼠脂肪組織UCP-1蛋白表達A:對照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;與對照組比較:*P<0.05;與低溫低氧組比較:#P<0.05

圖7 大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1蛋白表達

圖8 大鼠腎周白色脂肪組織UCP-1蛋白表達

圖9 大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1免疫熒光染色A:對照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;綠色熒光:UCP-1蛋白;藍色熒光:DAPI

圖10 大鼠腎周白色脂肪組織UCP-1免疫熒光染色A:對照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;綠色熒光:UCP-1蛋白;藍色熒光:DAPI

3 討論

肥胖是目前威脅人類健康的重大問題,對于如何減控體質量成為目前研究熱點及難點。低氧環境下的體質量減輕是近年發現的一個新的生理現象。研究發現,世居高原的藏族群體除體質量較輕、體型較勻稱外,經篩查該群體EGLN1基因和與脂代謝密切相關的PPARA基因表達也明顯降低[5]。本研究通過高脂喂食構建肥胖大鼠模型,結果顯示,與對照組相比,低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠體質量、體脂均降低,且低溫低氧組大鼠體質量、體脂低于低氧組、低溫組,探究了低氧/冷暴露對肥胖大鼠模型白色脂肪棕色化的影響機制。

對于短期的高山跋涉和低氧訓練減重等機制的研究結果雖然不一致,但都顯示出了短期低氧暴露對減重和脂代謝的促進作用。有研究報道高山跋涉[6]和低氧訓練[7]過程中體質量降低主要由體脂率降低所致。國內格日力 等[8]的研究顯示平原人暴露在海拔3.5 km以上高原環境后體質量將降低,且與常氧環境比較,自然高原環境和人工模擬氧暴露更易致體質量和體脂含量下降,減脂效果更好。有研究者通過免疫組化揭示了白色脂肪與棕色脂肪生理活動的差異,白色脂肪的主要功能是將體內多余的能量以三酰甘油的形式儲存起來,可以消耗能量熱,調節體溫[9-10]。調控體內白色脂肪與棕色脂肪的含量與比例可消耗機體多余的能量并促進局部甚或全身的脂肪消耗。 與白色脂肪棕色化、棕色脂肪代謝主要相關的經典基因有脂形成基因PPAR-γ2、解偶聯蛋白UCP-1、脂肪分化的輔激活基因PRDM16等。在脂肪組織內,基因PRDM16可與PPAR-γ2結合使UCP1高表達,觀察特定環境下三種基因的不同表達,可推斷出白色脂肪棕色化及棕色脂肪內脂代謝的動態變化過程。

PPAR-γ是一種配體激活的轉錄因子,參與多種代謝過程中的基因調控,PPAR-γ活化能增加胰島素敏感脂肪細胞數量,促進線粒體生成,增加UCP-1表達,在脂肪組織分化中起著重要作用[11-13]。UCP-1是棕色脂肪組織發揮產熱活性最重要的分子。UCP-1對機體維持體溫非常重要,尤其是在嚙齒類動物、新生兒和成年人群體,且其水平與肥胖相關的產熱功能密切相關,是棕色脂肪細胞形成和活性評價的一個重要指標[14-15]。PRDM16可看作是棕色脂肪分化的輔激活因子,可調控PPARα、CtBP、PGC-1α、PPAR-γ等的轉錄活性,誘導棕色脂肪特有基因的表達,同時使白色脂肪的基因關閉。PPAR-γ是PRDM16的受體,一些人體研究[16]顯示,人體白色脂肪分化為棕色脂肪主要依賴PRDM16。PRDM16的表達又會促進白色脂肪中UCP1的表達,即白色脂肪棕色化,從而促進向棕色脂肪的分化[17]。所以PRDM16通過調控PPAR-γ并激活相關轉錄功能可刺激棕色脂肪細胞的形成,在促進脂肪細胞分化過程中發揮重要作用。

該研究顯示短期低氧或寒冷環境下肥胖小鼠體脂率均降低, 白色脂肪組織中的基因PPAR-γ2表達下調、PRDM16與UCP-1表達上調,考慮為低氧或寒冷可能促進了PPAR-γ2與PRDM16的結合,并抑制了前體細胞向白色脂肪細胞的轉化。在棕色脂肪組織中PPAR-γ2與 PRDM16的表達上調,而UCP-1表達上調差異更顯著,表明棕色脂肪細胞形成明顯增加,棕色脂肪組織代謝加快,產熱活性加大,低氧/冷暴露環境加深加快了這一過程。

綜上所述,低氧/冷暴露可通過調控脂肪內PPAR-γ2、PRDM16通路使UCP-1高表達,誘導白色脂肪棕色化并影響大鼠體質量。