夾脊電針通過抑制Notch信號通路對脊髓損傷大鼠運動功能的影響

魏江曼,安郁坤,胡夢萱,陳和木

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)包括脊髓結構與功能的損傷,一般由脊柱骨折等外傷性因素引起,造成損傷部位微環境的改變及損傷平面以下運動感覺功能、胃腸道功能等障礙[1]。電針(electroacupuncture, EA)作為一種中醫治療方法,已被證實對SCI具有積極的治療效果,如改善損傷部位局部微環境、減輕水腫和炎癥反應、抑制神經元凋亡和瘢痕形成等[2]。但既往研究[3]多在督脈,而對于脊髓兩旁夾脊穴的研究較少。夾脊穴的解剖學位置與脊髓旁神經根位置重合,夾脊電針對SCI的治療作用已被初步證實,但其治療機制尚不完全清楚。該研究探索夾脊穴電針干預與Notch信號通路的關系,以進一步揭示其治療SCI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與分組 健康清潔級雄性大鼠72只,體質量(250±20)g,均由安徽醫科大學實驗動物中心提供,生產許可證號:LLSC20221105。將72只大鼠隨機分為假手術(sham)組、SCI組、電針(SCI+EA)組和針刺(SCI+AP)組,每組18只。每組按術后時間分為3個亞組,3天亞組、7天亞組和14天亞組,每個亞組6只。sham組只接受胸10節段(T10)的椎體切除術。其他3組中:SCI組只造成SCI,不做其他治療干預,SCI+EA組在損傷后第2天開始接受電針治療;SCI+AP組在損傷后第2天開始接受針刺治療。大鼠自由獲得水和食物,并給予20～25 ℃溫度、50%～65%溫度條件和12 h/12 h明暗照明。實驗過程均遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》規定。

1.1.2試劑與儀器 Notch 3一抗購自武漢ProteintechGroup公司;Hes 3一抗、Notch 4一抗和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)一抗購自美國Affinity公司;通用型二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京Zsbio公司;TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司;SYBR Green PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司;ECL Plus發光試劑盒、裂解液購自上海碧云天公司。徠卡切片機購自德國Leica 公司(貨號:RM2016);生物組織自動包埋機購自湖北貝諾醫療科技有限公司(貨號:ZT-12M);顯微鏡購自日本OLYMPUS公司(貨號:CX43)、Real-time PCR儀購自瑞士Roche公司(貨號:Lightcycler 96)、電泳凝膠成像儀購自美國Bio-RAD公司(貨號:ChemiDoc XRS+System)。一次性無菌針灸針購自吉林長春愛康醫療器械有限公司(0.25 mm×13 mm);電針儀購自江蘇佳健醫療器械股份有限公司(型號:CMNS6-1)。

1.2 實驗方法

1.2.1造模方法 造模前所有動物禁食8 h,稱重后給予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉。以下手術過程在無菌條件下進行:將大鼠固定在手術臺上,剃除手術區域毛發,并進行常規消毒。以T10段為中心,從脊柱正中做縱行切口,逐層剝離皮下組織,去除T10及部分T9、T11的椎板,充分暴露該節段背側硬脊膜。用自制Allen脊髓撞擊器以10 g×5 cm 的能量垂直撞擊T10段脊髓,造成脊髓的急性壓迫性損傷。以大鼠局部脊髓出現充血、全身痙攣、痙攣性擺尾作為造模成功的標志,然后逐層縫合被切開組織。術后予腹腔注射青霉素(100 U/d),連續3 d抗感染治療,每日早晚予腹部按摩2次,幫助大鼠二便的排泄。sham組僅切除椎板暴露脊髓組織,不損傷脊髓,其余3組均在切除椎板的基礎上損傷脊髓。

1.2.2針刺和電針治療方法 將大鼠于俯臥位固定于自制的鼠板上,并暴露損傷的脊髓節段。SCI+AP組在術后第2天,取距損傷處上下端兩個椎體的棘突間隙距中線旁開3～4 mm的夾脊穴,用針灸針向內斜刺4～5 mm深,使針尖觸及椎板。然后將SCI+EA組連接電針儀,同一導線的兩個夾子夾持在同側上下兩個針灸針針柄處,治療頻率為2/100 Hz,電流強度為 1～2 mA,以治療部位肌肉輕微顫動但未引起病理損傷為宜,1次/d,15 min/次,連續14 d。sham組和SCI組大鼠僅用相同方法固定于板上15 min,不進行針刺。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1體質量與運動功能 分別在術前和術后第3、7、14 d記錄每組大鼠的體質量,并在第3、7、14 d使用Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)[4]開放場運動測試評估大鼠的后肢運動功能,其滿分為21分,最低0分。評估方法為將大鼠放在1個開口容器中,測試者敲擊容器壁觀察大鼠后肢各關節的運動情況。此過程由2名不知情專業人員記錄2次獨立BBB評分,計算出每只大鼠的平均值。

1.3.2取材 術后第3、7、14天,在BBB測試完成后,用過量10%水合氯醛對大鼠行腹腔麻醉。開胸,從左心室插管,剪開右心耳,然后灌注生理鹽水,直到有澄清液從右心耳流出,再灌注4%多聚甲醛1 h。打開椎弓管,取出損傷段約1 cm長的脊髓,浸泡在多聚甲醛中固定24 h。然后放入生物組織自動包埋機處理。對于需要做實時定量聚合酶鏈反應(real time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)和免疫印跡分析的大鼠,在用相同方法灌注完生理鹽水后打開椎弓管,取出損傷段約1 cm長脊髓組織,在液氮中快速冷凍,并在-80 ℃下儲存待用。

1.3.3蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色 將包埋后的組織切成4 μm厚的切片,放入烤箱烤干。烤干后依次進行脫蠟、蘇木精溶液和伊紅溶液的染色、脫水、二甲苯透明和封片。最后經顯微鏡鏡檢后進行圖像采集分析。

1.3.4qPCR 使用qPCR法檢測Hes3、Notch1、Notch3和Notch4的mRNA表達水平。制備好脊髓組織勻漿后,使用TRIzol溶液自各組大鼠脊髓樣本中分離RNA。使用帶有SYBR Green的qPCR系統和針對每個目標基因的引物對每個樣本進行qPCR反應。qPCR引物序列見表1。實時qPCR的步驟為:在95 ℃、10 min激活,95 ℃、15 s,60 ℃、45 s,40個循環。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)被作為內在陽性對照和正常化因子。每組設置3個重復孔,使用2-ΔΔCt法檢測目標基因的表達。

表1 引物序列

1.3.5免疫印跡分析 將勻漿后的組織加入裂解液進行裂解,離心后取上清液進行BCA法蛋白濃度測定。將等量蛋白質使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質分離,然后轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PDVF)膜上,并室溫封閉1 h。在4 ℃下孵育一抗兔多抗隆抗體Hes 3(1 ∶1 000)、Notch 3 (1 ∶1 000)、Notch 4 (1 ∶1 000)和內參GAPDH(1 ∶1 000)搖床過夜,然后,在室溫下孵育二抗2 h。使用ECL發光試劑盒,經凝膠成像儀顯影。使用Image J軟件進行圖像量化分析,計算Hes 3、Notch 3和Notch 4蛋白的相對表達量。

1.3.6免疫組織化學染色 從石蠟塊上切下連續4 μm厚的切片。將切片與膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP, 1 ∶100)一抗抗體在4 ℃下孵育過夜,然后滴加辣根過氧化物酶標記的高敏兔小鼠通用二抗,在室溫下孵育50 min。隨后在顯微鏡下進行DAB顯色,然后使用蘇木精染色液對細胞核復染。最后在顯微鏡下觀察切片,并收集圖像。用蘇木精染色的細胞核為藍色,DAB的陽性表達為棕黃色。用Image J軟件分析每張切片的GFAP表達區域圖像,并統計陽性表達面積。

2 結果

2.1 各組大鼠的體質量和BBB評分比較各組大鼠的體質量變化和BBB評分統計結果見表2、3,折線圖見圖1A、B。如體質量曲線(圖1A)所示,從整體趨勢來看,sham組大鼠的體質量呈現上升趨勢,其余3組則為下降趨勢,且通過斜率可以看出,在術后前3 d體質量的下降速度最快,這可能與手術麻醉和創口的影響有關;與sham組相比,其余3組的體質量均下降(P<0.01);第7天和第14天時,SCI+EA和SCI+AP組高于SCI組(P<0.01),且SCI+EA組比SCI+AP組更高(P<0.05)。以上結果說明,電針和普通針刺能緩解SCI術后大鼠體質量的下降,而且電針的作用效果優于普通針刺。如BBB評分曲線(圖1B)所示,術后第1天,除sham組外,其余3組的評分均為0,表示造模成功;術后第3天時,SCI+EA、SCI+AP和SCI組之間差異無統計學意義;在術后第7 天時,SCI+EA的BBB評分略高于SCI組(P<0.05)和SCI+AP組(P<0.05),到術后第14天時,SCI+EA組高于SCI組(P<0.01)和SCI+AP組(P<0.01),且SCI+AP組也顯示出高于未進行干預的SCI組(P<0.05)的趨勢。這些結果說明,電針和普通針刺在不同程度上都能起到促進SCI大鼠后肢運動功能恢復的作用,電針的起效時間比普通針刺快,且對后肢功能的恢復效果更明顯。

圖1 各組大鼠體質量(A)和BBB評分(B)折線圖與sham組比較:*P<0.05;與SCI組比較:#P<0.05;與SCI+EA比較:&P<0.05

表2 4組大鼠術后不同時間段體質量統計

表3 4組大鼠術后不同時間段BBB評分統計(分,

2.2 各組大鼠HE染色比較假手術組大鼠的脊髓切片顯示正常的中央管、灰質和白質,無出血性壞死、水腫或變性。前角神經元的細胞核大而圓,核仁清晰。而其他3組的脊髓結構均被破壞,中央管、灰質和白質出現不同程度的出血,灰質中的前角神經元發生核固縮。在術后第3天,SCI組損傷區周圍的灰質和白質出現水腫和結構破壞,灰質邊界模糊,灰質和白質之間可見空泡,并可見白質大量出血。此外,神經元的結構被破壞,神經元腫脹,部分神經元出現核固縮。術后第7天,灰質和白質水腫,結構紊亂,模糊不清,中央受損區周圍的灰質和白質之間仍可見空泡。術后第14天,灰質和白質之間的界限模糊,出血消失,但空泡仍然可見。相比于SCI組,SCI+EA組和SCI+AP組在第7天和第14天的脊髓的形態學恢復程度更好。經電針和針刺治療后,脊髓的水腫減輕,受損區的中央管、灰質和白質的出血減少,結構也有所恢復。并且SCI+EA組的恢復效果優于SCI+AP組。這些結果表明,電針和針刺干預都能促進SCI大鼠的脊髓結構恢復,減輕水腫和出血,且電針的效果優于普通針刺。見圖2。

圖2 各組大鼠脊髓組織HE染色情況 ×100

2.3 各組大鼠脊髓組織Hes3、Notch1、Notch3和Notch4mRNA的表達水平比較與sham組相比,其他3組的Hes3、Notch1、Notch3和Notch4的mRNA表達水平明顯增高(P<0.05),在第7天時達到最高水平,第14天時顯示出回落趨勢。與SCI組相比,SCI+EA組和SCI+AP組的Hes3、Notch1、Notch3和Notch4降低(P<0.05),且在第7天和第14天時,SCI+EA組比SCI+AP組更低(P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 各組大鼠Hes 3、Notch 1、Notch 3和Notch 4的mRNA表達水平A:Hes 3;B:Notch 1;C:Notch 3;D:Notch 4;與sham組比較:*P<0.05;與SCI組比較:#P<0.05;與SCI+EA比較:&P<0.05

表4 4組大鼠術后不同時間Hes 3、Notch 1、Notch 3、Notch 4的實時定量PCR表達情況統計

2.4 各組大鼠脊髓組織Hes 3、Notch 3和Notch 4蛋白表達水平比較各組大鼠脊髓組織Hes 3、Notch 3和Notch 4蛋白的表達與mRNA表達呈現一致的趨勢,即在SCI術后增高(P<0.01),在第7天時達到最高水平,第14天時顯示出回降趨勢。見圖4。與sham組相比,SCI+EA組和SCI+AP組Hes3、Notch3、Notch4蛋白表達減少(P<0.05),且在第7天和第14天時SCI+EA組比SCI+AP組更低(P<0.05),與qPCR的結果一致。以上結果說明夾脊電針具有顯著抑制SCI術后Notch信號通路和Hes 3表達的作用,夾脊針刺也具有相同作用,但效果次于電針。

圖4 各組大鼠Hes 3、Notch 3和Notch 4的蛋白條帶曝光圖及灰度值統計結果A、B:Hes 3;C、D:Notch 3;E、F:Notch 4;a:sham組;b:SCI組;c:SCI+EA組;d:SCI+AP組;與sham組比較:*P<0.05;與SCI組比較:#P<0.05;與SCI+EA比較:&P<0.05

2.5 第14天時各組大鼠脊髓GFAP免疫組化染色結果在第14天時對大鼠脊髓組織的GFAP進行免疫組化檢測,染色結果見圖5A,陽性表達面積統計結果見圖5B。與sham組相比,SCI組的GFAP表達增多(P<0.05);而與SCI組相比,SCI+EA組(P<0.05)和SCI+AP(P<0.05)組GFAP表達減少,但仍高于sham組(P<0.05),且SCI+EA組低于SCI+AP組(P<0.05)。以上結果說明,SCI術后第14天時,夾脊電針和針刺能減少受損區域GFAP的出現,且電針的抑制效果比普通針刺強。

圖5 術后第14天時各組大鼠GFAP的免疫組化陽性表達情況和陽性表達面積統計結果 ×200A:sham組;B:SCI組;C:SCI+EA組;D:SCI+AP組;E:各組陽性表達面積百分比統計結果;與sham組比較:*P<0.05;與SCI組比較:#P<0.05;與SCI+EA比較:&P<0.05

3 討論

SCI后會經歷急性期、亞急性期和慢性期三個階段,急性期主要表現為組織水腫和炎癥,之后神經元凋亡逐漸增多,過渡到亞急性期,而到了慢性期后,星形膠質細胞會大量生成瘢痕組織,阻礙神經元再生[5]。

神經干細胞是一種具有自我復制和分化多能性的細胞,在中樞神經系統受損、缺血時,能分化為星形膠質細胞[6]。SCI后,機械壓力導致膠質細胞迅速死亡。隨后,損傷部位出現炎癥反應,并使幼稚的星形膠質細胞被激活并大量分化,此后一系列分化導致瘢痕形成性星形膠質細胞出現且大量增多,最終形成膠質瘢痕[7]。GFAP是星形膠質細胞的一種獨特結構蛋白,在SCI后,迅速釋放到生物流體中,被認為是星形膠質細胞獨特的生物標志物[8]。本實驗用GFAP標記星形膠質細胞,發現夾脊電針抑制了GFAP的生成,其機制可能是由于其抑制了神經干細胞向星形膠質細胞的轉化。

電針在誘導神經元的分化中起到了積極作用,這一過程與Notch信號通路有關[9]。Notch信號通路是一種高度保守的信號轉導通路,包括Notch受體、Notch配體和相關蛋白[10]。Notch途徑的活性由堿性螺旋-環-螺旋(basic helix loop helix,bHLH)基因控制,bHLH基因是Notch信號通路的直接靶基因,分為促進型和抑制型。促進型包括Mash1等,其主要功能是促進神經干細胞分化為神經元;抑制型包括Hes3等,其會抑制神經干細胞分化為神經細胞,保持神經干細胞的特性,使其分化為星形膠質細胞[11],最終形成瘢痕組織。SCI后,脊髓微環境中的Notch配體上調,受體和配體結合激活這一途徑,因此,抑制Notch信號通路的激活是促進SCI恢復的關鍵。本實驗對Notch通路相關信號因子Notch3、Notch4和抑制性bHLH基因家族Hes3的基因水平和蛋白水平進行雙重檢測,研究表明,夾脊電針能抑制Notch通路的激活和Hes3基因的表達,從而減少GFAP的生成,促進脊髓功能的恢復。

夾脊穴為經外奇穴,《中國針灸學》將夾脊穴定位于T1-L5棘突下,左右旁開0.5寸,位于督脈與足太陽膀胱經之間,是溝通兩條經脈的樞紐。督脈為陽脈之海,總督一身陽氣,而膀胱經,通過背俞穴與五臟六腑相連,因此,通過針刺夾脊穴,可以同調兩經氣血,激發兩經經氣,進而調節全身陽氣[12]。后世醫家認為,相較于足太陽膀胱經,夾脊穴與督脈關系更密切,并將夾脊穴歸屬于督脈,與督脈一起,形成“督脈帶”[13],明確了督脈和夾脊穴的整體性。對于神經系統疾病如SCI的治療,已經從督脈電針擴展到了夾脊電針,并且療效顯著[14]。

本實驗選取的夾脊穴,是受損脊髓節段上下的兩對夾脊穴,靠近脊神經根位置。有研究[15-16]認為,穴位和神經根距離較近時,更有利于引起針感傳導反應,直達病灶部位。本研究表明,夾脊電針和針刺雖然都對SCI的恢復有積極作用,但電針對脊髓的恢復程度和對Notch信號通路的抑制作用都比普通針刺效果明顯。這可能是因為,相較于針刺,電針不但可以產生機械性物理刺激,還對穴位產生脈沖電流刺激[17]。當脈沖電流施加于受損脊髓時,會使細胞內外的離子產生定向移動,從而使細胞內外的離子濃度和分布發生顯著變化,進而消除細胞膜極化狀態,引起神經元興奮[18]。此外,為了減少適應性耐受導致療效減弱,該研究選擇了2/100 Hz的疏密波模式(疏波2 Hz,密波100 Hz)。然而,該研究只討論了夾脊電針對SCI急性期的影響,而夾脊電針對SCI大鼠的長期影響有待繼續探究。