LC-MS/MS同時測定22種膽汁酸在孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤中的應用

趙 凡,張 倫,葉 露,張佳怡,余 蕓,黃倩倩,王建青

膽汁酸由膽固醇在肝細胞中代謝而來,是膽汁的主要脂質成分,膽汁酸在生物體內能夠乳化脂肪、促進脂肪和膽固醇的吸收[1-2]。肝臟中主要合成的初級膽汁酸包括人的膽酸(cholic acid,CA)和鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)以及嚙齒動物的α-鼠膽酸(α-muricholic acid,α-MCA)和β-鼠膽酸(β-muricholic acid,β-MCA),其中CA與CDCA進入腸道后,在腸道菌群的作用下形成去氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)和石膽酸(lithocholic acid,LCA)等次級膽汁酸[3-4]。 以上游離的膽汁酸可以與甘氨酸和牛磺酸結合形成相應的結合型膽汁酸。其中大部分膽汁酸通過肝腸循環途徑在回腸末端重吸收返回肝臟,剩余少量膽汁酸進入全身循環和隨糞便排除[4]。

膽汁酸在細胞中過度積累會對細胞產生毒性,肝細胞中膽汁酸的累積最終將導致肝細胞損傷[5]。不同膽汁酸的生理功能差異較大,有研究[6]報道,LCA的毒性相對較大。測定孕鼠妊娠期體內膽汁酸含量變化,了解妊娠期孕鼠體內膽汁酸的分布情況,運用于妊娠期間孕婦體內膽汁酸紊亂相關疾病的預防具有重要意義。該實驗建立LC-MS/MS檢測孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤樣本中的膽汁酸譜的方法,以期為后續生物樣本測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 癌癥研究所(institute of cancer research,ICR)小鼠(8周齡SPF級,雄性36～38 g,20只;雌性27～29 g,40只)購自浙江維通利華實驗動物科技有限公司,動物生產許可證號:SCXK(浙)2019-0001。在適宜環境(溫度20～25 ℃,濕度50%±5%)飼養7 d。本研究所使用的動物實驗均已通過安徽醫科大學動物倫理委員會審查并批準(編號:20200523)。

1.1.2儀器 AB Sciex Triple Quad 4500型三重四級桿串聯質譜儀(購自美國AB公司);1200系列高效液相色譜儀(購自美國Agilent公司);Analyst1.4.2 數據處理系統、1524R高速冷凍離心機和6K低速離心機(購自珠海黑馬醫學儀器公司);電子天平(型號:XS105DU,購自上海MettlerToledo公司);超純水儀(型號:Synergy,購自美國Milli-pore公司);渦旋振蕩器(購自美國VortexCenie公司);Bioprep-24R生物樣品均質機(購自杭州奧盛儀器有限公司)。

1.1.3藥品與試劑 CA(純度 ≥ 98%,批號:SLCC7722)、LCA(純度 ≥ 95%,批號:BCBW1723)、CDCA(純度≥ 97% ,批號:MKBS2816V)、牛磺脫氧膽酸(taurodeoxycholate acid,TDCA,純度 ≥ 95%,批號:SLBX3488)、牛磺膽酸(taurocholic acid,TCA,純度≥ 95%,批號:SLCM1787)、甘氨鵝去氧膽酸(glycine chenodeoxycholic acid,GCDCA,純度 ≥ 97%,批號:SLCD4748)、甘氨熊去氧膽酸(glycine ursodeoxycholic acid,GUDCA,純度 ≥ 96% ,批號:BCBS9852V) 、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA,純度 ≥ 99% ,批號:SLBT3485) 、甘氨膽酸(glycocholic acid,GCA,純度 ≥ 97% ,批號:SLBR1284V)、牛磺熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA,純度 ≥ 98%,批號:13190318)、牛磺鵝去氧膽酸(taurochenodesoxycholic acid,TCDCA,純度 ≥ 98%,批號:SLCJ5790)和甘氨去氧膽酸(glycine deoxycholic acid,GDCA,純度 ≥ 97%,批號:BCCG0654),以上藥品購自美國西格瑪奧德里奇貿易有限公司。牛磺豬去氧膽酸(taurine hyodeoxycholic acid,THDCA,純度 ≥ 98%,批號:B16A10K94146)、豬去氧膽酸(hyodeoxycholic acid,HDCA,純度 ≥ 98%,批號:J24GB152684)、牛磺石膽酸(taurine cholic acid,TLCA,純度 ≥ 97%,批號:D11GS171051)、甘氨豬去氧膽酸(glycine hyodeoxycholic acid,GHDCA,純度 ≥ 98%,批號:Y23N9K75826)、甘氨石膽酸(glycine cholic acid,GLCA,純度 ≥ 98%,批號:B29J11K119775)、DCA(純度 ≥ 98.5%,批號:BCCG6672)、α-MCA(純度 ≥ 95%,批號:J14HS178006)和去氫膽酸(dehydrocholic acid,DHCA,純度 ≥ 98.5%,批號:S30J9I64022),以上藥品購自上海源葉生物科技有限公司。牛磺-β-鼠膽酸(taurine-β-muricholic acid,T-β-MCA,純度 ≥ 98%,批號:700244P-1MG-D-010)、β-鼠膽酸(β-MCA,純度 ≥ 98%,批號:700233P-1MG-C-010)和牛磺-α-鼠膽酸(taurine-α-muricholic acid,T-α-MCA,純度 ≥ 98%,批號:700243P-1MG-B-010),以上藥品購自美國Avanti? Polar Lipids公司。200目粉末狀活性炭、高效液相色譜級水、乙醇、冰乙酸、甲醇和乙酸銨,均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1動物處理 小鼠在適宜環境中飼養7 d,第8天21時將該批小鼠按照2只雄性和4只雌性小鼠的比例進行合籠,次日7時檢查陰道栓,共20只雌鼠檢查出陰道栓。將有陰道栓的雌性小鼠定為妊娠第0天[(gestational day,GD)0],從中隨機抽取7只孕鼠,飼養至GD16進行剖殺,收集母血、母肝、羊水和胎盤。

1.2.2色譜條件 色譜柱:Phenomenex Gemini 3 μm NX-C18 110A (100 mm × 2.0 mm);流動相:A相為含有0.1%冰乙酸的4 mmol/L乙酸銨溶液,B相為甲醇;柱溫為40 ℃;流速為0.4 ml/min;進樣量為10 μl。梯度洗脫程序見表1。

表1 樣品分析的洗脫條件

1.2.3質譜條件 電噴霧離子源,負離子檢測,掃描方式為多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM),電噴霧電壓:4 200 V;碰撞氣:4 psi;氣簾氣:30 psi;霧化氣:50 psi;輔助氣:50 psi;離子源溫度:500 ℃。22種膽汁酸及內標質譜優化參數見表2。

表2 22種膽汁酸及內標質譜優化參數

1.3 樣品前處理

1.3.1血清和羊水的處理 血清和羊水各吸取50 μl,加入250 μl甲醇和200 ng/ml的內標溶液50 μl 后,渦旋混勻1 min,于-20 ℃放置20 min,在4 ℃低溫離心機中以10 200 r/min,將上清液轉移至新的1.5 ml離心管中,氮氣吹干;用50 μl 甲醇:水溶液(1 ∶1,V/V)溶解干燥沉淀,在4 ℃低溫離心機中以10 200 r/min,取上清液進行分析。

1.3.2肝臟和胎盤的處理 取肝臟和胎盤組織各100 mg,加入裝有1 ml 75%乙醇的1.5 ml離心管內,隨后進行組織勻漿,先置于50 ℃水浴2 h后,在4 ℃低溫離心機中以7 900 r/min,取上清液50 μl 置于1.5 ml離心管中,加入200 ng/ml的內標溶液50 μl ,渦旋混勻1 min,在4 ℃低溫離心機中以10 200 r/min,將上清液轉移至新的1.5 ml離心管中,氮氣吹干;用50 μl 甲醇:水溶液(1 ∶1,V/V)溶解干燥沉淀,在4 ℃低溫離心機中以10 200 r/min,取上清液進行分析。

1.3.3空白基質的制備 分別取孕鼠血清、羊水、肝臟和胎盤的勻漿液,配制成活性炭濃度0.1 g/ml勻漿混懸液,震蕩渦旋1 h,在4 ℃低溫離心機中以11 600 r/min,取上清液備用。

1.3.4膽汁酸儲備液和內標溶液及系列工作液的配制 分別取22種膽汁酸組分標準品約10 mg,精密稱定,在10 ml容量瓶中用50%甲醇水溶液定容至10 ml,得到1 mg/ml的各膽汁酸溶液。隨后將22種膽汁酸組分混勻后定容至10 ml,得到各膽汁酸濃度為10 000 ng/ml的膽汁酸儲備液,最終將膽汁酸儲備液用空白基質稀釋成2.5、5、10、25、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 ng/ml的混合對照品曲線系列工作液,冷藏保存。

取內標對照品約10 mg,精密稱定,用50%甲醇水溶液定容至10 ml,充分混勻得到濃度為1 mg/ml的內標混合液,隨后用50%甲醇水溶液稀釋成200 ng/ml的內標工作液,冷藏備用。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1專屬性 孕鼠空白基質、孕鼠空白基質加入膽汁酸標準品和內標對照品工作液的色譜圖分別見圖1。

圖1 22種膽汁酸和內標LC-MS/MS色譜圖A:空白基質;B:空白基質加膽汁酸混標及內標品;C:膽汁酸混標色譜圖;1:α-MCA;2:β-MCA;3:CA;4:UDCA;5:THDCA;6:CDCA;7:DCA;8:DHCA;9:GCA;10:GUDCA;11:GHDCA;12:GCDCA;13:GDCA;14:GLCA;15:LCA;16:T-α-MCA;17:T-β-MCA;18:TCA;19:TUDCA;20:HDCA;21:TCDCA;22:TDCA;23:TLCA

表3 22種膽汁酸線性范圍、回歸方程以及相關系數

2.1.3準確度與精密度 取膽汁酸混合儲備液制備10、50、500 ng/ml 3種濃度的質控樣品,每種濃度平行5份,連續進樣3 d,計算準確度和精密度,結果見表4。血清樣本中各膽汁酸的準確度在89%～106%,日間和日內精密度RSD在0.5%～7.4%,結果符合要求。

表4 血漿質控樣品中各膽汁酸的準確度、精密度、基質效應以及提取回收率

2.1.4基質效應與提取回收率 配制3種標準樣品(A1、A2、A3),每種樣品配制3個濃度(10、50、500 ng/ml)。A1是使用50%甲醇配制不含基質的混合對照品溶液;A2是使用空白基質氮吹干燥后,使用50%甲醇復溶配制的混合對照品溶液;A3是按照1.2.2項下處理的空白基質配制混合對照品溶液。分別進樣,記錄各膽汁酸和內標峰面積。A2/A1為質控濃度的基質效應,A3/A2為質控濃度的提取回收率,基質效應準確度在88%～110%,RSD在0.5%～15%,提取回收率在84%～108%,RSD在1%～15%,均符合要求,結果見表4。

2.1.5穩定性 配制樣品基質低、中、高3種質控濃度樣品,每個質控濃度樣品平行制備5份,考察放置于自動進樣器24 h、室溫放置6 h后,-80 ℃反復凍融3次及-80 ℃冰箱中冷凍保存90 d后的穩定性,結果均穩定。

2.2 孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤的膽汁酸含量測定通過建立的LC-MS/MS方法測定7只孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤的膽汁酸成分。見表5,在母鼠血清膽汁酸成分含量較高的是CA、TCA和β-MCA;肝臟中膽汁酸成分含量較高的是TCA、T-β-MCA; 羊水膽汁酸成分含量較高的是TCA;胎盤中膽汁酸成分含量較高的是TCA。由于不同部位膽汁酸成分含量不同,部分膽汁酸低于儀器檢測限而未能檢測出來。

3 討論

膽汁酸是人體內一種重要的內源性物質,而且其理化性質差異較大,存在多種同分異構體[7]。為了使各膽汁酸成分能夠在短時間內有效分離,本研究經過多次重復性實驗,發現流動相A相中以含有0.1% 冰乙酸的4 mmol/L乙酸銨水溶液分離效果最理想。國內關于孕鼠體內生物樣本中膽汁酸成分的測定方法學未見報道。本實驗主要使用蛋白沉淀法作為孕鼠血清和羊水的前處理方法,該方法簡單快捷[8],對于孕鼠肝臟和胎盤,使用恒溫水浴孵育的方法提取膽汁酸進行前處理[9]。對取得處理好的上清液,進行氮吹干燥后復溶上機檢測,能夠得到很好的檢測效果。

本研究測定了孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤的22種膽汁酸成分,包含游離型和結合型在內的初級和次級膽汁酸。檢測的結果表明,在孕鼠血清中,游離型膽汁酸含量最高的是CA,占比為29.43%,結合型膽汁酸含量最高為TCA,占比為20.16%。而在孕鼠肝臟、羊水、胎盤中含量最高的均為TCA,且占比均超過50%,并且發現胎盤中可檢測的膽汁酸成分最少。在人體中,含量最高的初級膽汁酸有CA和CDCA,以及次級膽汁酸DCA、LCA和UDCA[10-11]。

臨床上對于妊娠期肝病多以血清總膽汁酸水平含量作為診斷指標[12]。血清總膽汁酸對于妊娠期肝病的診斷特異性較差,這可能會給臨床明確診斷妊娠期肝病帶來一定難度,無法早期準確識別妊娠期肝病且易產生混淆和誤診,甚至會導致不良的圍產期結局,包括不必要的醫源性早產、剖宮產和意外的宮內胎兒死亡[13]。因此,依靠總膽汁酸對妊娠期肝病進行診斷和鑒別診斷具有明顯的局限性,該研究使用孕鼠作為實驗對象,模擬孕婦妊娠期,建立LC-MS/MS檢測膽汁酸譜的方法學有利于妊娠期肝病診斷和治療,具有重要的臨床應用價值。