肌肽對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠腎臟鐵死亡和炎癥的影響

張 崧,劉雪琪,姜 玲,吳永貴

糖尿病腎病是糖尿病常見的微血管并發癥,也是導致終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)的主要原因之一[1-2]。其特征是蛋白尿及腎功能的進行性減退,延緩其進展仍然是一個全球性難題。肌肽(carnosine,CAR)是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的水溶性二肽,天然存在于骨骼肌、大腦和心臟中。CAR在體內廣泛分布,且具有多種生物學活性如抗炎、抗氧化應激、抑制RAS系統活性、抑制AGEs及ALEs和緩沖生理酸堿度[3]。課題組前期研究[4]表明CAR可以通過抑制焦亡減輕糖尿病腎病中的足細胞損傷。近期研究[5-6]表明鐵死亡在糖尿病腎病發生發展中起關鍵作用,通過上調核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2, NRF2)可以抑制鐵死亡,從而延緩糖尿病腎病進展[7]。該研究旨在探討CAR對鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導的糖尿病小鼠腎臟鐵死亡和炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組本實驗使用STZ誘導C57BL/6J(約6～8周齡)小鼠構建1型糖尿病小鼠模型,正常雄性C57BL/6J小鼠作為對照。雄性C57BL/6J小鼠(約6～8周齡)購自安徽醫科大學實驗動物中心,生產許可證號:SCXK(皖)2017-001,使用許可證號:SYXK(皖)2017-006,并在安徽醫科大學動物中心SPF級動物房飼養。實驗小鼠在標準條件下的籠子中進行飼養,并在恒溫(22±2)℃、濕度為60% 、光暗周期為12 h/12 h的房間中,可以自由獲取食物和水。禁食12 h后,根據小鼠體質量,給予小鼠腹腔注射50 mg/kg的STZ,連續5 d。在1周后取小鼠尾靜脈血,用血糖儀測量血糖,高于16.7 mmol/L則造模成功為糖尿病模型。所有小鼠被隨機分為5組(每組6～8只):正常對照(NC)組、肌肽(CAR)組、STZ模型(STZ)組、STZ模型+肌肽(STZ+CAR)組、STZ模型+鐵死亡抑制劑組(STZ+Fer-1組)。根據每籠小鼠體質量,稱計算好的量的CAR粉末于EP管中,給藥前估算好每籠老鼠每天飲用水總量,將稱好的CAR粉末溶于飲用水中。CAR組和STZ+CAR組小鼠均同樣給藥,CAR給藥濃度為1 g/kg。每日給藥共16周,并且每天測量每籠小鼠的飲水量和體質量。將Fer-1粉末溶解在DMSO中,用生理鹽水稀釋,使DMSO的最終濃度為1%,根據每只小鼠體質量計算注射量,Fer-1溶液每天經腹腔注射給藥,濃度為5 mg/kg,共給藥16周。實驗動物均經過安徽醫科大學動物研究倫理委員會批準(編號:LLSC20170487)。

1.2 主要儀器石蠟包埋機、石蠟切片機和冰凍切片機購自德國Lecia公司;多功能酶標儀購自美國PE公司;BX 50光學顯微鏡購自日本OLYPUS公司;電泳儀和濕轉儀購自美國伯樂公司;熒光顯影系統Li-Cor/Odyssey購自美國LI-COR Biosciences公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計購自上海Theromo公司;透射電鏡(JEM 1400)購自日本電子公司。

1.3 方法

1.3.1一般生化指標的檢測 稱量并記錄小鼠的體質量。剪去小鼠尾尖,采小鼠尾尖血通過血糖儀測量小鼠血糖。小鼠灌胃CAR 16周后,吸入5%異氟醚麻醉小鼠,用剪刀剪去小鼠眼球周圍的胡子,以免影響取血。用彎鑷子摘取小鼠右側眼球進行眼球取血,同時左手輕輕按壓小鼠心臟,將血收集在標記好的EP管中,約700 μl。將收集好的小鼠血液放置在室溫靜置2 h,然后放入離心機離心20 min,轉速為2 000 r/min,收集血清樣本,按照說明書檢測血清CRE和BUN水平。取出小鼠腎臟組織,用紗布吸干組織表明多余水分,稱量腎臟的質量并計算腎質量與體質量的比值。進行動物實驗前,先在SPF動物房綁好代謝籠,將每只小鼠放入,給予食物和水,24 h后,收集每只小鼠的尿液,離心機離心盡可能去除尿液里的糞便,記錄尿量,按照說明書步驟檢測小鼠24 h尿白蛋白含量。

1.3.2腎臟組織病理形態學觀察 腎臟組織用4%多聚甲醛固定,脫水后包埋在石蠟中,切成4 μm厚切片,按照說明書進行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色和糖原染色(periodic acid-schiff, PAS)染色。

1.3.3腎臟組織電鏡觀察 將腎臟組織切成2 mm ×2 mm大小,先依次放置于3%戊二醛和1%鋨酸中進行固定處理,用丙酮對其脫水,最后用環氧樹脂對組織進行包埋。定位,制作超薄切片。用醋酸鈾和枸櫞酸鉛對切片進行雙重染色。然后在透射電鏡下觀察腎臟細胞線粒體形態和結構并拍照。

1.3.4免疫熒光染色 石蠟切片于烘箱中70 ℃加熱至蠟融化,依次浸泡于二甲苯和梯度乙醇中。滴加內源性過氧化氫酶阻斷劑覆蓋組織,室溫靜置20 min。使用枸櫞酸鹽進行微波加熱修復抗原。隨后10%山羊血清在37 ℃封閉1 h。使用活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒檢測小鼠腎臟ROS,并在顯微鏡下觀察載玻片并拍照。使用Image J分析圖片,計算陽性面積百分比。

1.3.5Real-time PCR實驗 使用TRIzol試劑從腎組織中提取總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計評估RNA的濃度和純度。將RNA逆轉錄成cDNA并進行擴增。PCR循環條件如下:95 ℃、1 min,95 ℃、15 s,60 ℃、15 s,72 ℃、45 s,共40個循環。采用SYBR?Green RT-PCR檢測白細胞介素(interleukin,IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、IL-6、β-actin 的mRNA水平。以2-ΔΔCt法分析測定基因表達水平。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR目的基因引物序列

1.3.6Western blot實驗 取適量腎臟組織,加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)提取蛋白,并進行BCA蛋白定量分析。蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,隨后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。配制1×快速封閉液,封閉15～30 min。隨后將膜分別放入抗β-actin(1 ∶5 000)、抗GPX4(1 ∶500)和抗ACSL4(1 ∶1 000)一抗中4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次,每次10 min。加入HRP標記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗(1 ∶5 000)孵育50 min。TBST洗膜3次,使用化學發光系統曝光條帶。使用Image J測量條帶的灰度值。

1.3.7MDA、GSH和Fe2+含量測定 每組均切除腎組織(50 mg),置于冷生理鹽水中。用振動均質器將腎組織均質。離心10 min后收集上清液,測定細胞和組織的GSH、MDA和鐵濃度。按照說明書操作,將工作試劑和樣品添加到96孔板中進行分析。

2 結果

2.1 CAR對小鼠一般指標的影響與NC組相比,STZ組小鼠腎質量/體質量(P<0.01)和血糖(P<0.001)升高;與STZ組相比,STZ+CAR組腎質量/體質量和血糖無明顯變化。與NC組相比,STZ組CRE、BUN上升(P<0.001);與STZ組相比,STZ+CAR組和STZ+Fer-1組CRE(P<0.001,P<0.01)、BUN(P<0.01)水平下降。見表2。

表2 CAR對STZ小鼠一般指標的影響

2.2 CAR對小鼠腎組織病理形態的影響HE染色結果顯示,NC組小鼠腎小管形態正常,無擴張,無明顯炎癥細胞浸潤,細胞形態清晰,而STZ組小鼠腎小管明顯擴張、大量炎癥細胞浸潤。與STZ組相比,STZ+CAR組小鼠腎小管擴張明顯改善、炎癥細胞浸潤減少,見圖1A,差異有統計學意義(P<0.01)。PAS染色結果顯示,STZ組小鼠糖原沉積明顯,腎小管擴張,而STZ+CAR組小鼠腎臟糖原沉積減少,腎小管擴張改善,見圖1B,差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 CAR對STZ小鼠腎臟組織病理改變的影響 ×400A:HE染色各組腎臟病理損傷圖片觀察及其直方圖分析;B:PAS染色觀察CAR對STZ小鼠腎臟組織糖原沉積的影響及其直方圖分析;a:NC組;b:CAR組;c:STZ組;d:STZ+CAR組;e:STZ+Fer-1組;與NC組比較:**P<0.01;與STZ組比較:##P<0.01

2.3 CAR對小鼠腎組織炎癥的影響Real-time PCR檢測顯示,與NC組相比,CAR組腎臟組織中IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α mRNA表達差異無統計學意義,而STZ組中的表達均升高(P<0.001,P<0.01,P<0.001,P<0.01);與STZ組相比,STZ+CAR 組IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的mRNA表達下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。結果表明STZ小鼠腎臟組織炎癥反應增加,CAR可以減輕STZ小鼠腎臟炎癥反應。見圖2。

圖2 Real-time PCR法檢測CAR對STZ小鼠腎臟組織IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α表達的影響A: Real-time PCR法檢測小鼠腎臟組織中IL-1β的表達;B:Real-time PCR法檢測小鼠腎臟組織中IL-6的表達;C:Real-time PCR法檢測小鼠腎臟組織中MCP-1的表達;D:Real-time PCR法檢測小鼠腎臟組織中TNF-α的表達;a:NC組;b:CAR組;c:STZ組;d:STZ+CAR 組;e:STZ+Fer-1組;與NC組比較:**P<0.01,***P<0.001;與STZ組比較:#P<0.05,##P<0.01

2.4 CAR對小鼠腎組織ROS的影響免疫熒光檢測結果顯示,與NC組相比,CAR組腎臟組織ROS表達差異無統計學意義,STZ組小鼠腎臟中ROS水平升高(P<0.001);與STZ比較,STZ+CAR組和STZ+Fer-1組ROS水平下降(P<0.01)。見圖3。

圖3 免疫熒光法檢測CAR對STZ小鼠腎臟組織ROS表達的影響 ×400A:NC組;B:CAR組;C:STZ組;D:STZ+CAR組;E:STZ+Fer-1組;與NC組比較:***P<0.001;與STZ組比較:##P<0.01

2.5 CAR對小鼠腎臟線粒體形態的影響透射電鏡檢測小鼠腎臟線粒體形態,與NC組相比,STZ小鼠線粒體腫脹,膜密度增加,線粒體脊減少或缺失,然而,STZ+CAR組和STZ+Fer-1組小鼠線粒體腫脹減輕,膜密度降低,線粒體脊增加,說明STZ小鼠腎臟的線粒體發生了鐵死亡樣改變,CAR可以抑制STZ小鼠腎臟線粒體形態的改變。見圖4。

圖4 透射電鏡檢測CAR對STZ小鼠腎臟組織線粒體形態的影響 ×10 000A:NC組;B:CAR組;C:STZ組;D:STZ+CAR組;E:STZ+Fer-1組

2.6 CAR對STZ誘導的小鼠腎臟鐵死亡的影響Western blot檢測各組腎臟組織GPX4以及ACSL4蛋白水平的表達,與NC組相比,NC+CAR組腎臟組織GPX4和ACSL4表達差異無統計學意義,STZ組腎臟組織GPX4的表達下降(P<0.001),ACSL4表達升高(P<0.01);與STZ組相比,STZ+CAR組和STZ+Fer-1組腎臟組織GPX4表達升高,ACSL4表達下降,差異有統計學意義(P<0.01)。MDA、GSH和Fe2+檢測結果顯示,與NC組相比,STZ組腎臟組織MDA和Fe2+含量表達升高,GSH含量表達下降(P<0.001);與STZ組相比,STZ+CAR組和STZ+Fer-1組腎臟組織GSH含量表達升高,MDA和Fe2+含量表達下降,差異有統計學意義(P<0.01)。上述結果提示STZ小鼠腎臟組織發生了鐵死亡,而CAR抑制了糖尿病腎病的鐵死亡。見圖5。

圖5 小鼠腎臟組織GPX4和ACSL4蛋白水平表達及MDA、GSH和Fe2+含量測定A～C:Western blot法檢測CAR對STZ小鼠腎臟組織GPX4和ACSL4蛋白水平表達灰帶圖及直方圖;D:小鼠腎臟MDA含量;E:小鼠腎臟GSH含量;F:小鼠腎臟Fe2+含量;a:NC組;b:CAR組;c:STZ組;d:STZ+CAR組;e:STZ+Fer-1組;與NC組比較:**P<0.01,***P<0.001;與STZ組比較:##P<0.01

3 討論

糖尿病腎病的發病機制復雜,既往對糖尿病腎病的研究主要集中在自噬、凋亡、纖維化等,糖尿病腎病仍缺乏有效的治療,因此,尋找新的機制及新的干預靶點十分重要。糖尿病腎病在臨床上是以蛋白尿和腎功能的進行性失代償為特征。研究[2-3,8]表明漢黃芩素通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路來改善糖尿病腎病中的腎小管上皮細胞損傷,小檗堿抑制JAK2/STAT3信號通路緩解高糖誘導的足細胞EMT和凋亡。

鐵死亡是一種新型的Fe2+依賴的細胞調節性死亡,其主要特征是鐵超載和細胞內ROS的持續積累,導致細胞內脂質氫過氧化物的致命堆積。谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)是導致鐵死亡的關鍵酶,細胞內谷胱甘肽(GSH)消耗或GPX4失活可誘導鐵死亡[9]。鐵死亡與許多生理和病理過程有關,包括癌癥、神經退行性疾病、器官缺血再灌注損傷和腎功能衰竭[10]。越來越多的研究[11]表明鐵死亡可能是糖尿病腎病的治療靶點,鐵死亡可能通過HIF-1α/HO-1通路引起腎小管損傷。

CAR作為天然的二肽,在體內廣泛分布,且具有多種生物學活性,如抗炎、抗氧化應激、抑制RAS系統活性、抑制AGEs及ALEs和緩沖生理酸堿度等[12]。CAR具有較強的抗氧化能力,能清除氧化應激條件下細胞膜中過度脂肪酸氧化產生的ROS和α,β-不飽和醛。該研究表明,CAR治療后糖尿病小鼠的CRE和BUN下降,然而CAR不改變STZ小鼠血糖,表明CAR不是通過降低血糖來發揮保護腎臟的作用。此外,CAR還能改善腎臟組織的病理損傷。進一步研究表明,CAR能夠降低糖尿病小鼠腎臟炎癥細胞因子(IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α)的水平。透射電鏡結果也顯示,CAR改善了STZ小鼠腎臟線粒體的腫脹,膜密度增加,線粒體脊減少或缺失。同時,該研究結果顯示,STZ小鼠腎臟組織GPX4表達下降、ACSL4表達升高,CAR處理后逆轉了這些改變。這些結果說明CAR對STZ小鼠腎臟損傷具有抗炎和抗鐵死亡作用。

據報道,CAR可以通過降低脂質過氧化來改善低氧誘導的心肌損傷[13],CAR可通過抑制焦亡改善糖尿病腎病中足細胞的損傷[4]。該研究評估了CAR對鐵死亡的影響,結果證實了CAR可以抑制STZ小鼠腎臟中鐵死亡的激活。

綜上所述,該研究表明CAR抑制了STZ誘導的糖尿病小鼠腎臟組織的鐵死亡和炎癥。同時,CAR治療后明顯改善了STZ小鼠的腎功能和腎臟病理損傷。因此,CAR在糖尿病性腎損傷的治療上有潛在的可能性。該研究僅從體內實驗初步探討CAR對糖尿病性腎損傷具有保護作用,但CAR調控鐵死亡具體機制尚不明確,有待進一步探討。