LncRNA-MIAT通過抑制miR-519d-3p激活EZH2促進甲狀腺癌的惡性行為

吾甫爾·依馬爾, 王護國

(新疆醫科大學第一附屬醫院血管甲狀腺外科, 新疆 烏魯木齊 830054)

甲狀腺癌(thyroid cancer,THCA)是最常見的內分泌惡性腫瘤之一,近30年來其發病率持續上升[1]。盡管大多數甲狀腺癌患者表現出良好的生存,但據報道,初次手術治療后的復發率為8%至23%,這極大地影響了患者的生活質量[2]。近年來,研究表明,由于基因組不穩定或表觀遺傳標記改變導致的基因異常表達在甲狀腺癌的調控中起著重要作用[3]。在眾多理論中,競爭內源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假說尤其受到人們的關注,這一假說描述一個由微小RNA(microRNA,miRNA)介導的復雜的轉錄后調控網絡:通過共享一個或多個miRNA響應元件,長鏈非編碼RNA(LncRNA)競爭性地與miRNA的結合,從而在功能上釋放了受miRNA調控的靶mRNA[4]。然而,目前甲狀腺癌中的ceRNA機制還不十分清楚,需要進一步的研究。心肌梗死相關轉錄物LncRNA(LncRNA-MIAT)是一種關鍵的促癌基因,已被研究證實在多種癌癥中表達增高,而且可以參與調控肝癌和胃癌等惡性腫瘤的進展[5]。然而,LncRNA-MIAT在甲狀腺癌中的作用與機制仍不十分清楚。本研究通過TCGA數據庫(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)、Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、Targetscan(https://www.targetscan.org/vert_80/)等生物信息學網站預測到與LncRNA-MIAT相關的ceRNA網絡中涉及28個miRNA和203個mRNA,其中在TCGA數據中miR-519d-3p在甲狀腺癌中極低表達,而且MIAT和其中的EZH2在包括甲狀腺癌在內的多種類型癌癥中呈極顯著正相關關系。因此我們假設LncRNA-MIAT可能在甲狀腺癌中扮演促癌作用,且存在LncRNA-MIAT-miR-519d-3p-EZH2這條調控網絡,并且本文通過體外實驗研究了LncRNA-MIAT對甲狀腺癌細胞惡性行為的調控作用并初步探討了機制。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑:人正常甲狀腺細胞系Nthy-ori 3-1和人甲狀腺癌細胞系FTC-133均購自中國科學院典型培養物保藏中心。胎牛血清(FBS)、DMEM培養基均購自美國Gibco公司。兔抗EZH2抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的山羊抗兔 IgG二抗均購自英國Abcam公司。用于阻斷EZH2活性的EPZ-6438購于美國MCE公司。免疫熒光原位雜交試劑盒購于上海碧云天公司。Cy3標記的抗小鼠二抗和Cy3標記的抗兔二抗均購于美國Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養和分組:①細胞培養FTC-133細胞和Nthy-ori 3-1細胞用含有10% FBS的DMEM培養基,置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。②FTC-133細胞的轉染和分組:分別將LncRNA-MIAT過表達載體(pcDNA3.1-LncRNA-MIAT,LncRNA-MIAT)、空載體(Empty vector)(均由上海吉瑪公司進行構建)轉染至FTC-133細胞,分別命名為LncRNA-MIAT組、Empty vector組。將miR-519d-3p inhibitor(購于上海吉瑪公司)轉染至FTC-133細胞,命名為miR-519d-3p inhibitor組。用APTO-263處理FTC-133細胞,命名為APTO-263組。另外,將LncRNA-MIAT過表達載體和miR-519d-3p inhibitor聯合轉染FTC-133細胞,命名為LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組。每組均孵育24h。進行后續檢測。

1.2.2實時定量PCR:收集細胞的總RNA,逆轉錄為cDNA,行PCR擴增。以GAPDH為內參,采用2-△△CT法計算LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3FISH實驗:CY3標記的LncRNA-MIAT探針由廣州瑞博生物有限公司設計合成。4%多聚甲醛固定FTC-133細胞,與含有LncRNA-MIAT探針的雜交緩沖液在37℃暗處雜交過夜。用DAPI(北京Solaribo)染細胞核。在熒光顯微鏡下觀察切片。

1.2.4Western blot:提取各組細胞的總蛋白質。通過BCA蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。然后實施SDS-PAGE分離蛋白質:70V 30min轉120V 90min。然后將蛋白條帶以300mA轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2h后,將膜與一抗在4℃下孵育過夜:anti-EZH2(1∶1000),anti-GAPDH抗體(1∶2500)。然后,將膜與HRP偶聯的山羊抗兔IgG(1∶2000)孵育1h。用ECL檢測試劑顯示蛋白條帶,并用ImageJ軟件分析每個條帶的灰度值。

1.2.5雙熒光素酶報告基因實驗:合成含LncRNA-MIAT野生型(MIAT-wt)或突變型(MIAT-mut)結合位點的DNA片段,克隆到pMIR-GLO熒光素酶載體。分離重組質粒并測序。將miR-519d-3p mimics和mimics NC分別按照說明書使用Lipofectamine?3000與MIAT-wt/MIAT-mut片段共轉染FTC-133細胞。轉染4h后,更換培養基,將細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養48h。用雙熒光素酶試劑盒檢測各組的熒光素酶活性。另外,將合成的EZH2 3’UTR 野生型(EZH2-wt)或突變型(EZH2-mut)與miR-519d-3p mimics和mimics NC分別共轉染FTC-133細胞,以檢測miR-519d-3p都與EZH2的調控作用,其余實驗方法同上。

1.2.65-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)染色實驗:各組細胞用含50μM EdU試劑(美國RiboBio)的DMEM培養基在37℃、5% CO2下孵育2h。用PBS洗滌2次,用4%多聚甲醛固定30min,用2mg/mL甘氨酸溶液中和,加入100μL 0.5% Triton X-100進行通透性處理。PBS洗滌后,每孔加入100μL 1×Apollo染料,室溫孵育30min。隨后加入100μL DAPI,繼續孵育10min,并在熒光顯微鏡下進行拍照。

1.2.7平板克隆形成實驗:將各組FTC-133細胞濃度調整為1×103個/mL,培養在6孔板上,進行14d的常規培養,每隔3d換液一次,用甲醇固定并染色,對克隆計數并進行統計。

1.2.8流式細胞術:采用ACSVerse(美國BD公司)流式細胞儀對各組細胞進行進行Annexin V-FITC和PI染色。收集細胞并將細胞密度調整為5×105,總體積為200μL,再次離心棄掉上清,加入500μL 1×Binding Buffer,輕輕重懸細胞。隨后加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI輕輕混勻,室溫避光下孵育15min,并用流式細胞儀進行檢測。

1.2.9Transwell侵襲和遷移實驗:細胞侵襲實驗預先在上室膜(孔徑為8μm)用基質膠涂層,將細胞(5×104/mL)懸浮在含無血清培養基的Transwell上室中,而下室充滿含有20%FBS的培養基。孵育48h,去除上表面的剩余細胞,并固定膜下表面細胞,用結晶紫染色,在光學顯微鏡下(40x放大倍數)計數。細胞遷移實驗除不預先對上室膜進行基質膠涂層外,其余同細胞侵襲實驗。

2 結 果

2.1LncRNA-MIAT在甲狀腺癌中的表達:從TCGA數據庫中獲取甲狀腺癌中的基因表達數據,觀察到與癌旁正常組比,THCA組的LncRNA-MIAT的表達升高1.5倍(t=2.664,P=0.008),見圖1A。另外,qPCR結果顯示,與Nthy-ori 3-1組(1.00±0.05)比,FTC-133組(4.12±0.31)中LncRNA-MIAT的表達增加3.2倍(t=17.210,P=2.5e-6),見圖1B。通過FISH法檢測人甲狀腺癌細胞系FTC-133中LncRNA-MIAT的定位,結果顯示,LncRNA-MIAT主要定位在細胞質內,見圖1C。

圖1 甲狀腺癌中LncRNA-MIAT的表達

圖2 甲狀腺癌中LncRNA-MIAT下游靶點的預測和表達驗證

2.2甲狀腺癌中LncRNA-MIAT下游靶點的預測和表達驗證:從TCGA數據庫中獲取甲狀腺癌中的差異表達的miRNA和靶基因表達數據集,結合targetscan和starbase在線分析的miRNA-target和LncRNA-miRNA調控關系網絡進行綜合預測和分析,最終將甲狀腺癌中LncRNA-MIAT下游靶點確定為miR-519d-3p和EZH2。TCGA數據庫中觀察到甲狀腺癌中EZH2 mRNA的水平表達升高1.29倍(t=19.352,P=1.21e-11)。而且甲狀腺癌中LncRNA-MIAT與EZH2的表達水平呈顯著正相關(r=0.466,P=8.4e-29)。qPCR法檢測Nthy-ori 3-1和FTC-133中miR-519d-3p的表達,結果顯示,與Nthy-ori 3-1組比,FTC-133組中miR-519d-3p的表達降低92.3%(t=64.969,P=5.6e-15),而與Nthy-ori 3-1組比,FTC-133組中EZH2的mRNA表達和蛋白表達水平都上調,差異有統計學意義(t=23.461和19.729,P=1.5e-10和2.3e-5)。

2.3FTC-133中LncRNA-MIAT與miR-519d-3p和miR-519d-3p和靶基因EZH2的關系驗證:miR-519d-3p mimics和MIAT-wt共轉染抑制了熒光素酶活性,(t=4.225,P=0.007,圖3A)。miR-519d-3p mimics和EZH2-wt共轉染也抑制了熒光素酶活性(t=5.147,P=0.004,圖3B)。與Empty vector組相比,LncRNA-MIAT組的LncRNA-MIAT明顯上調(t=11.581,P=0.003,圖3C),而miR-519d-3p的表達明顯下調,EZH2的表達明顯上調(t=12.054,P=0.002,圖3D-3E)。對FTC-133細胞轉染miR-519d-3p inhibitor后,觀察到LncRNA-MIAT的表達水平無影響(P>0.05,圖3C),而miR-519d-3p的表達明顯下調,EZH2的表達明顯上調(t=12.054和15.421,P=0.002和0.001,圖3D-3E)。用EZH2的抑制劑EPZ-6438處理FTC-133細胞,對miR-519d-3p和LncRNA-MIAT的表達均無影響(P>0.05,圖3C和圖3D),可以明顯抑制EZH2的表達(t=7.885和9.524,P=0.009和0.008,圖3D-3E)。與LncRNA-MIAT組比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組的LncRNA-MIAT的表達無明顯變化(P>0.05,圖3C),而miR-519d-3p的表達被進一步抑制,EZH2的表達則被顯著上調(t=5.887和6.251,P=0.019和0.011,圖3D-3E)。另外,與miR-519d-3p inhibitor組比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組的miR-519d-3p的表達被進一步抑制,EZH2的表達則被顯著上調(t=8.207和4.984,P=0.005和0.016,圖3D-3E)。

圖3 甲狀腺癌中LncRNA-MIAT、miR-519d-3p和EZH直接關系的實驗驗證

2.4LncRNA-MIAT通過抑制miR-519d-3p激活EZH2調控甲狀腺癌細胞的增殖:與Empty vector組相比,LncRNA-MIAT組的EdU陽性細胞百分比和克隆細胞數均顯著上調(P<0.05)。FTC-133細胞轉染miR-519d-3p inhibitor后,觀察到Edu陽性細胞百分比和克隆細胞數均顯著上調(P<0.05)。EZH2的抑制劑EPZ-6438則明顯抑制EdU陽性細胞百分比和克隆細胞數(P<0.05)。與LncRNA-MIAT組比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組的Edu陽性細胞百分比和克隆細胞數均顯著上調(P<0.05)。與miR-519d-3p inhibitor組比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組的EdU陽性細胞百分比和克隆細胞數均顯著上調(P<0.05)(圖4A-4D)。

圖4 LncRNA-MIAT通過抑制miR-519d-3p激活EZH2調控甲狀腺癌細胞增殖

2.5LncRNA-MIAT通過抑制miR-519d-3p激活EZH2調控甲狀腺癌細胞的凋亡:與Empty vector組相比,LncRNA-MIAT組的細胞凋亡率顯著下調(P<0.05)。FTC-133細胞轉染miR-519d-3p inhibitor后,觀察到細胞凋亡率顯著下調(P<0.05)。而EZH2的抑制劑EPZ-6438明顯增加了細胞的凋亡率(P<0.05)。與LncRNA-MIAT組比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組的細胞凋亡率顯著下調(P<0.05)。與miR-519d-3p inhibitor組比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組的細胞凋亡率也顯著下調(P<0.05)(圖5)。

圖5 LncRNA-MIAT通過抑制miR-519d-3p激活EZH2調控甲狀腺癌細胞的凋亡

2.6LncRNA-MIAT通過抑制miR-519d-3p激活EZH2調控甲狀腺癌細胞的侵襲和遷移:與Empty vector組相比,LncRNA-MIAT組的細胞侵襲數和細胞遷移數顯著上調(P<0.05)。FTC-133細胞轉染miR-519d-3p inhibitor后,觀察到細胞侵襲數和細胞遷移數顯著上調(P<0.05)。而EZH2的抑制劑EPZ-6438明顯減少了細胞侵襲數和細胞遷移數(P<0.05)。與LncRNA-MIAT組比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組的細胞侵襲數和細胞遷移數顯著下調(P<0.05)。與miR-519d-3p inhibitor組比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor組的細胞侵襲數和細胞遷移數也顯著下調(P<0.05)(圖6A-6C)。

圖6 LncRNA-MIAT通過抑制miR-519d-3p激活EZH2調控甲狀腺癌細胞的侵襲和遷移

3 討 論

甲狀腺癌患者的預后通常較為良好,因為手術或者放射性碘治療,在大多數情況下都可以實現完全改善[5]。然而,目前的診斷和治療策略并不完全有效。在過去的幾十年里,研究人員已經確定甲狀腺腫瘤發生是一個復雜的生物學過程,其特征是多種非編碼RNA分子的異常表達,主要包括miRNA和LncRNA,這些分子在過去十年中被多次提出可作為癌癥通路的調節因子,并有作為癌癥預后生物標志物的潛力[6]。我們發現在甲狀腺癌細胞系中LncRNA-MIAT表達明顯上調,而miR-519d-3p明顯下調。而且在本研究中,通過雙熒光素酶基因報告法我們發現在甲狀腺癌細胞中LncRNA-MIAT與miR-519d-3p相互作用,從而調控了EZH2信號,這在甲狀腺癌的發生發展中具有重要作用。

LncRNA-MIAT最初被認為與心肌梗死相關,但研究表明沉默MIAT顯著抑制內皮細胞增殖和遷移[7]。研究人員發現LncRNA-MIAT/miR-150-5p/ZEB1信號通路在非小細胞肺癌中起致癌作用[8]。而且,LncRNA-MIAT通過與miR-361-3p的結合,可以促進前列腺癌的發展,下調LncRNA-MIAT通過上調miR-361-3p的表達抑制前列腺癌細胞的活力并誘導細胞凋亡[9]。表明,LncRNA-MIAT是一種促癌基因,可以通過調控miRNA促進腫瘤的進展。本研究在甲狀腺癌中同樣證實了是一種促癌基因,促進了癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并抑制細胞凋亡,這種功能與其直接靶點miR-519d-3p密切相關,因為LncRNA-MIAT過表達和miR-519d-3p inhibitor的功能幾乎一致,均促進了癌細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制了細胞凋亡。因此,我們的研究表明,LncRNA-MIAT通過抑制miR-519d-3p促進了甲狀腺癌的進展。

EZH2是本研究中的另一個關鍵靶點。它是多梳抑制復合體2的核心成分之一,多梳抑制復合體的作用是賴氨酸甲基轉移酶,特別是催化H3K27me3的甲基化[10]。EZH2表達升高在包括甲狀腺癌在內的多種癌癥中均被廣泛認可,其表達與腫瘤惡性、侵襲性和不良預后密切相關。LncRNA已被證明可以通過轉錄后機制直接或間接地調節EZH2的水平。如在胃癌中,LINC00673通過與LSD1和EZH2相互作用調節致癌生物學行為[11]。而miRNA則可以與EZH2 mRNA轉錄本結合,調控其穩定性、完整性和翻譯,從而直接影響EZH2蛋白的表達。例如,miR-101-3p通過轉錄后下調EZH2,降低多種腫瘤類型的侵襲和遷移能力,包括成神經管細胞瘤和食管鱗狀細胞癌[12,13]?？偟膩碚f,這些觀察結果是我們關于LncRNA-MIAT、miR-519d-3p和EZH2之間關系猜想的基礎。本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實了中LncRNA-MIAT與miR-519d-3p的靶向關系以及miR-519d-3p與EZH2的靶向關系。并且通過抑制EZH2對甲狀腺癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響與miR-519d-3p inhibitor和過表達LncRNA-MIAT明顯相反。而且 miR-519d-3p inhibitor可以上調EZH2的表達,LncRNA-MIAT過表達也可以抑制miR-519d-3p并上調EZH2的表達。因此,這表明,LncRNA-MIAT可以通過抑制miR-519d-3p上調EZH2,從而促進甲狀腺癌細胞增殖、遷移、侵襲并抑制細胞凋亡。

綜上所述,甲狀腺癌中LncRNA-MIAT表達顯著增加,過表達LncRNA-MIAT抑制甲狀腺癌細胞凋亡,促進甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲行為,其關鍵分子機制是通過抑制miR-519d-3p上調EZH2的表達。我們的研究為LncRNA-MIAT在癌癥中的作用提供了新的見解,并可能有助于甲狀腺癌治療和診斷診斷工具的開發。