CircITGB6調節miR-542-3p/PCNA軸對卵巢癌細胞順鉑耐藥性的影響及其機制

廖圣銀, 蔡麗芳, 游夢星, 肖琳琳, 謝雪花, 黃偉明, 林 棲, 黃麗斌, 何麗梅

(福建省莆田市第一醫院腫瘤內科, 福建 莆田 351100)

卵巢癌(OC)是女性常見的惡性腫瘤之一,具有較高的發病率和死亡率[1]。目前,OC的主要治療方法是手術切除和以順鉑(DDP)為基礎的化療,但由于DDP耐藥的發生,OC患者的總生存率仍較低[2]。因此,有必要進一步研究OC癌變和DDP耐藥的分子機制,以改善OC患者的預后和生存率。環狀RNA(circRNA)由于獨特的閉環結構使其在生物體內極其穩定,許多研究證實circRNA與癌癥惡性進展有關[3],且其在癌癥化療耐藥中的作用也被許多研究證實[4]。最新研究發現CircITGB6在鉑類耐藥OC患者的腫瘤組織和血清中顯著升高,與預后不良相關[5],但其作用機制尚需深入探索。微小RNA(miR)-542-3p在上皮性OC組織和細胞系中下調,可在OC中作為腫瘤抑制性miRNA發揮作用[6],但其在OC中對DDP耐藥性機制的影響鮮有報道。增殖細胞核抗原(PCNA)作為一種在細胞增殖期大量表達的核蛋白,與腫瘤發生和發展中的作用密切相關,已有研究證明PCNA在OC組織中的表達水平明顯高于良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織,可能與OC發生、發展、侵襲和轉移相關[7]。生物信息學顯示miR-542-3p分別與CircITGB6、PCNA存在結合位點,但CircITGB6能否通過調節miR-542-3p/PCNA軸影響OC細胞順鉑(DDP)耐藥性尚未報道,故本研究旨在探討CircITGB6通過調節miR-542-3p/PCNA軸對OC細胞DDP耐藥性的研究。

1 材料與方法

1.1組織及細胞來源:選取2019年至2022年在莆田市第一醫院就診的66例OC患者,所有患者均接受手術治療,未接受化療或放療,于手術中收集腫瘤標本并儲存在液氮中。另選取66例因子宮肌瘤行全子宮雙附件切除患者的正常卵巢組織為對照組。參與本研究的所有病人或其近親屬均簽署知情同意書,且研究經莆田市第一醫院倫理委員會審核批準。人OC細胞系SKOV3和DDP抗性菌株(SKOV3/DDP)(美國ATCC);正常卵巢上皮細胞系(IOSE-80)(國家實驗細胞資源保藏中心)。SKOV3細胞在含有10% FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中培養。SKOV3/DDP細胞培養基中添加0.5 μg/mL的DDP。IOSE-80細胞在完全培養基中培養,細胞融合至80%時,胰蛋白酶消化進行傳代培養。

1.2主要試劑與儀器:CircITGB6抑制物(si CircITGB6)及陰性對照(si NC)、miR-542-3p模擬物(miR-542-3p mimics)、抑制物(miR-542-3p inhibitor)及相應陰性對照(mimics NC、inhibitor NC)、熒光素酶質粒報告(上海吉瑪制藥有限公司);TRIzol試劑(美國Invitrogen公司);細胞凋亡試劑盒、CCK-8試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司);Bcl-2相關X蛋白(Bax)、細胞增殖相關核抗原(Ki-67)、PCNA、β-actin一抗(英國Abcam公司)。美國Bio-Rad提供Real-time PCR儀;BioTek Instruments提供ELx 800酶標儀。

1.3方 法

1.3.1qRT-PCR檢測組織及細胞中CircITGB6、miR-542-3p、PCNA mRNA表達水平:TRIzol試劑提取OC組織和正常卵巢組織、SKOV3、SKOV3/DDP、IOSE-80細胞以及各組SKOV3/DDP細胞中的RNA,逆轉錄獲得cDNA,在Agilent Mx3000P PCR系統進行qRT-PCR分析。引物序列:CircITGB6上游5'-TGTGGTGACCCCTGTAACTC-3',下游5'-TGCACACACATTCACCACAG-3';miR-542-3p上游5'-GCGCGATATCGCGACGAGCGACC-3',下游5'-TTAAGCGAGCTATCGCGCGCGAGCG-3';PCNA上游5'-TGAAGCACCAAACCAGGAG-3',下游5'-GAAGGCATCTTTACTACACAGC-3';內參U6上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3',下游5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3';內參β-actin上游5'-GCAGAAGTGCGAAGAGGAGG-3',下游5'-GCTTGATGGAGTTGTCGGTGTA-3'。PCR反應體系:10μL SYBR Mix、1μL cDNA模板、0.5μL上下游引物。反應條件:95℃ 5min、95℃ 1min、60℃ 50s、72℃ 10min,共40個循環。以U6、β-actin為內參,采用2-△△CT法分析CircITGB6、miR-542-3p、PCNA表達。

1.3.2細胞分組及處理:取SKOV3/DDP細胞分為對照組(不經任何處理)、si NC組(轉染si NC)、si CircITGB6組(轉染si CircITGB6)、si CircITGB6+miR-542-3p inhibitor組(共轉染si CircITGB6、miR-542-3p inhibitor)、si CircITGB6+inhibitor NC組(共轉染si CircITGB6、inhibitor NC),轉染采用Lipofectamine TM 2000試劑。轉染48h后,各組均加入2 μg/mL的DDP處理24h,隨后進行各指標分析。

1.3.3CCK-8法檢測細胞增殖及耐藥性:將SKOV3/DDP接種到96孔板(1×103/孔),按照1.3.2中進行分組處理,向每孔中加入10μL CCK-8溶液,在37℃孵育2h后,使用酶標儀在450nm處測量每個孔的吸光度,計算細胞增殖率。耐藥性檢測:以0、2、4、8、16、32、64μg/L DDP溶液(100μL/孔)分別加入到各組細胞[10],培養48h后,采用CCK-8法檢測細胞增殖活性,計算細胞增殖抑制率,分析各組細胞藥物半數抑制濃度(IC50)值。

1.3.4流式細胞術檢測細胞凋亡:SKOV3/DDP細胞以1×106密度接種到24孔板中,并用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌兩次。然后將細胞懸浮在500μL結合緩沖液中,室溫下加5μL膜聯蛋白V-FITC和10μL PI在黑暗中染色5min。流式細胞儀分析細胞凋亡變化。

1.3.5雙熒光素酶實驗驗證miR-542-3p與CircITGB6、PCNA的靶向關系:分別將CircITGB6、PCNA與miR-542-3p mimics基因結合片段插入到熒光素酶pGL4載體中,構建CircITGB6、PCNA野生型質粒(CircITGB6-WT、PCNA-WT);利用基因突變技術構建CircITGB6、PCNA突變型質粒(CircITGB6-MT、PCNA-MT),之后將CircITGB6-WT、PCNA-WT及CircITGB6-MT、PCNA-MT分別與miR-542-3p mimics、mimics NC共轉染到SKOV3/DDP細胞,24h后測定細胞的熒光素酶活性,實驗重復3次。

1.3.6Western blot檢測相關蛋白表達水平:使用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白質并測定其濃度。蛋白質通過SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上,將膜與Bax、Ki-67、PCNA、β-actin一抗(1∶1000)共同孵育,洗滌后,與二抗(1∶2000)共同孵育,顯影,分析各蛋白含量。

2 結 果

2.1OC組織及細胞中CircITGB6、miR-542-3p、PCNA mRNA表達水平比較:與正常卵巢組織相比,OC組織CircITGB6、PCNA mRNA表達顯著增加(P<0.05),miR-542-3p表達顯著降低(P<0.05),見表1。與IOSE-80相比,SKOV3、SKOV3/DDP細胞CircITGB6、PCNA mRNA表達顯著增加,但miR-542-3p表達顯著降低(P<0.05);與SKOV3相比,SKOV3/DDP細胞CircITGB6、PCNA mRNA表達顯著增加,但miR-542-3p表達顯著降低(P<0.05),見表2。

表1 OC組織中CircITGB6 miR-542-3p PCNA mRNA表達水平

表2 不同OC細胞中CircITGB6、miR-542-3p PCNA mRNA表達水平

2.2各組SKOV3/DDP細胞增殖率變化:與對照組、si NC組比較,si CircITGB6組SKOV3/DDP細胞增殖率顯著降低(P<0.05);與si CircITGB6+inhibitor NC組比較,si CircITGB6+miR-542-3p inhibitor組SKOV3/DDP細胞增殖率顯著增加(P<0.05),見表3。

表3 各組SKOV3/DDP細胞增殖率變化

2.3各組SKOV3/DDP細胞對DDP耐藥性的影響:與對照組、si NC組比較,si CircITGB6組IC50值顯著降低(P<0.05);與si CircITGB6+inhibitor NC組比較,si CircITGB6+miR-542-3p inhibitor組IC50值顯著增加(P<0.05),見表4。

表4 各組SKOV3/DDP細胞對DDP耐藥性的比較

2.4各組SKOV3/DDP細胞凋亡率變化:與對照組、si NC組比較,si CircITGB6組凋亡率顯著增加(P<0.05);與si CircITGB6+inhibitor NC組比較,si CircITGB6+miR-542-3p inhibitor組凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖1、表5。

圖1 各組SKOV3/DDP細胞凋亡變化

表5 各組SKOV3/DDP細胞凋亡率的比較

2.5各組SKOV3/DDP細胞中CircITGB6、miR-542-3p、PCNA mRNA的表達水平比較:與對照組、si NC組比較,si CircITGB6組CircITGB6、PCNA mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),miR-542-3p表達水平顯著增加(P<0.05);與si CircITGB6+inhibitor NC組比較,si CircITGB6+miR-542-3p inhibitor組miR-542-3p表達水平顯著降低(P<0.05),PCNA mRNA表達水平顯著增加(P<0.05),CircITGB6無統計學差異(P>0.05),見表6。

表6 各組SKOV3/DDP細胞CircITGB6 miR-542-3p PCNA mRNA的表達比較

2.6驗證miR-542-3p與CircITGB6的靶向關系:Starbase數據庫顯示miR-542-3p與CircITGB6存在結合位點,如圖2。熒光素酶活性比較:CircITGB6 WT+miR-542-3p mimics組較CircITGB6 WT+mimics NC組降低(P<0.05),見表7。

圖2 數據庫預測miR-542-3p與CircITGB6的結合位點

表7 miR-542-3p與CircITGB6的靶向關系驗證

2.7驗證miR-542-3p與PCNA的靶向關系:Starbase數據庫顯示miR-542-3p與PCNA存在結合位點,如圖3。熒光素酶活性比較:PCNA WT+miR-542-3p mimics組較PCNA WT+mimics NC組降低(P<0.05),見表8。

圖3 數據庫預測miR-542-3p與PCNA的結合位點

表8 miR-542-3p與PCNA的靶向關系驗證

2.8各組SKOV3/DDP細胞中Ki-67、PCNA、Bax蛋白表達水平比較:與對照組、si NC組比較,si CircITGB6組Ki-67、PCNA蛋白水平顯著降低(P<0.05),Bax蛋白水平顯著增加(P<0.05);與si CircITGB6+inhibitor NC組比較,si CircITGB6+miR-542-3p inhibitor組Ki-67、PCNA蛋白水平顯著增加(P<0.05),Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05),見圖4,表9。

圖4 各組SKOV3/DDP細胞中Bax、Ki-67、PCNA蛋白表達(Western blot圖)

表9 各組SKOV3/DDP細胞中Bax Ki-67 PCNA表達的比較

3 討 論

據統計,超過70%的OC患者最終出現復發和轉移,其高死亡率和復發率的主要原因是缺乏高敏感性、特異性的早期診斷技術以及長期有效的治療方案[8]。因此尋找有效的治療靶點已成為近年來OC治療領域的一個焦點。

DDP被廣泛用作OC的有效一線治療選擇,DDP耐藥顯著影響卵巢癌患者的生存率。研究表明,circRNAs在OC腫瘤組織的化療耐藥和化療敏感中差異表達,參與OC化療耐藥的發展[9]。circITGB6作為一種新發現的circRNA,已有研究發現circITGB6表達在OC組織以及具有化療耐藥性的OC患者血清中明顯增加[5]。本研究發現OC患者癌組織及SKOV3/DDP中CircITGB6表達上調,推測CircITGB6可能與OC中DDP耐藥性有關。為了驗證此推測,本研究采用小分子干擾技術敲低CircITGB6表達,結果顯示,干擾CircITGB6后,SKOV3/DDP細胞增殖率及IC50、Ki-67表達顯著降低,凋亡率及Bax表達增加,提示干擾CircITGB6可能會降低細胞對DDP的耐藥性,CircITGB6可作為OC中DDP耐藥的潛在干預靶點。

circRNAs可以通過調控miRNAs發揮ceRNA的作用[8]。為了明確CircITGB6的作用機制,本研究采用StarBase生物信息學預測了CircITGB6的靶miRNA,結果顯示CircITGB6與miR-542-3p存在靶向結合位點,本研究通過雙熒光素酶實驗驗證了兩者的靶向關系。miR-542-3p在多項研究中被證實是一種腫瘤抑制因子,如miR-542-3p的表達在骨肉瘤組織和細胞系中顯著降低,上調miR-542-3p的表達可以抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡[10]。circ_PGAM1通過抑制miR-542-3p的表達促進上皮性卵巢癌的惡性進展[11]。本研究發現OC組織及SKOV3/DDP細胞中miR-542-3p表達被抑制,與之前報道結果吻合[6]。干擾CircITGB6后,miR-542-3p表達上調,提示CircITGB6可能通過靶向負調控miR-542-3p進而降低SKOV3/DDP細胞對DDP的耐藥性。為驗證該結論,本研究在干擾CircITGB6表達的基礎上,采用miR-542-3p inhibitor下調miR-542-3p表達進行回復驗證,結果發現miR-542-3p inhibitor逆轉了干擾CircITGB6對SKOV3/DDP細胞惡性行為的抑制。提示干擾CircITGB6可能通過靶向上調miR-542-3p表達,增強SKOV3/DDP細胞對DDP的敏感性。

細胞增殖能力是癌癥診斷中重要的預后生物標志物,PCNA被認為是增殖和DNA復制的標志。研究顯示,PCNA參與DDP耐藥[12];且PCNA的高表達與OC的發生、發展、侵襲和轉移具有相關性[7]。StarBase數據庫預測顯示miR-542-3p具有PCNA mRNA結合位點,雙熒光素酶實驗驗證了PCNA為miR-542-3p的靶標,本研究發現PCNA在OC組織及SKOV3/DDP中上調,miR-542-3p可靶向負調控PCNA表達,提示CircITGB6可能是通過上調miR-542-3p,抑制PCNA表達降低SKOV3/DDP細胞對DDP的耐藥性。綜上所述,干擾CircITGB6表達可通過調節miR-542-3p/PCNA軸降低SKOV3對DDP的耐藥性,成為治療OC的潛在靶點。