circ_0001658通過(guò)靶向miR-1179調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖細(xì)胞周期和凋亡

李 歡, 謝賢鑫, 孫 濤

(遼寧省腫瘤醫(yī)院乳腺內(nèi)科, 遼寧 沈陽(yáng) 110042)

乳腺癌起源于乳腺上皮組織,是世界上最常見(jiàn)的癌癥,也是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。乳腺癌的發(fā)生歸因于多種風(fēng)險(xiǎn)因素,如DNA損傷和基因改變。盡管在乳腺癌的早期診斷、手術(shù)干預(yù)、局部和全身輔助治療上取得了顯著進(jìn)展,但患者預(yù)后仍較差。所以,深入揭示該疾病發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)尋找新的治療方法意義重大。環(huán)狀RNAs(circRNAs)是一類(lèi)單鏈環(huán)狀分子,在真核生物中廣泛表達(dá),沒(méi)有聚腺苷酸化尾以及帽狀結(jié)構(gòu),能夠抵抗外切酶降解。研究發(fā)現(xiàn),Hsa_circ_0001658(circ_0001658)在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高,其高表達(dá)與TNM分期、組織分化程度顯著相關(guān),敲除circ_0001658可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活力,增加凋亡率[2]。另有研究指出這個(gè)circRNA能夠顯著增加骨肉瘤細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng),并抑制凋亡[3]。然而,還沒(méi)有數(shù)據(jù)表明是否circ_0001658參與乳腺癌的發(fā)展。Circinteractome預(yù)測(cè)顯示,circ_0001658包含miR-1179結(jié)合位點(diǎn)。先前的證據(jù)已經(jīng)表明此miRNA低表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期臨床分期和總生存期縮短相關(guān),它的模擬物限制乳腺癌細(xì)胞增殖以及運(yùn)動(dòng)[4]。盡管miR-1179在乳腺癌中作用已有報(bào)道,但circ_0001658可否通過(guò)調(diào)控miR-1179表達(dá)來(lái)影響乳腺癌進(jìn)展還沒(méi)有報(bào)道?；谝陨显?此研究探討circ_0001658對(duì)乳腺癌BT-549細(xì)胞表型變化的影響及分析circ_0001658對(duì)這些細(xì)胞行為的調(diào)控中是否涉及miR-1179。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選取在本院2017年1月至2019年1月期間治療的30例乳腺癌患者,獲得原發(fā)性乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織,于-80℃保存。每位患者均知情且同意,本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2材料:人乳腺癌細(xì)胞BT-549、DMEM、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自武漢普諾賽生物;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自日本Takara公司;Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;RIPA蛋白裂解液、MTT試劑盒、qRT-PCR試劑盒、雙熒光素酶基因檢測(cè)試劑盒由北京索萊寶生物提供;胰蛋白酶、BCA試劑盒購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物;凝膠制備試劑盒由福州飛凈生物提供;引物由上海生工生物合成。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組:將BT-549細(xì)胞鋪在6孔板(2×105個(gè)/孔),在正常條件下培養(yǎng)指導(dǎo)細(xì)胞達(dá)到75%左右匯合度,根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)分別準(zhǔn)備si-NC、si-circ_0001658、miR-NC、以及miR-1179和脂質(zhì)體的混合物,將混合物在室溫條件下孵育20min分別轉(zhuǎn)染至BT-549細(xì)胞;另外根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備si-circ_0001658、anti-miR-NC以及脂質(zhì)體混合物和si-circ_0001658、anti-miR-1179以及脂質(zhì)體混合物,并分別轉(zhuǎn)染至BT-549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后,用于后續(xù)分析。

1.4RT-qPCR:提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并參照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)定量RNA表達(dá)。Circ_0001658、miR-1179分別以β-actin和U6為內(nèi)參,2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。circ_0001658上游引物:5'-GCCCAATCTCTCCTGCAAGT-3';下游引物:5'-CCACCTAGGAGGAACTGACAA-3';β-actin上游引物:5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3';下游引物:5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3';miR-1179上游引物:5'-AAGCATTCTTTCATTGGTTGGA-3';下游引物:5'-CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC-3';U6上游引物:5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3';下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖:將BT-549細(xì)胞鋪在96孔板,培養(yǎng)24、48、72h后,將細(xì)胞繼續(xù)和MTT溶液孵育4h,隨之和DMSO室溫孵育5min,最后利用酶標(biāo)儀分析每孔樣品。

1.6PI單染法測(cè)定胃癌細(xì)胞周期:取各組BT-549細(xì)胞,PBS洗滌1次,離心后棄上清,乙醇固定細(xì)胞,室溫放置3h,PBS洗滌1次,離心后棄上清,加入100μL RNaseA,37℃水浴30min,再加入400μL PI染液,4℃避光反應(yīng)20min,流式細(xì)胞儀測(cè)定488nm處紅色熒光。

1.7Annexin V檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將各組BT-549細(xì)胞通過(guò)離心法收集,用合緩沖液重懸后,按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明將Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)各5μL和樣品混勻,孵育15min后,用流式細(xì)胞儀分析各組樣品。

1.8蛋白表達(dá)分析:應(yīng)用裂解液裂解各組樣品,通過(guò)離心提取細(xì)胞總蛋白,標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量蛋白濃度后,樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。膜上的非特異蛋白條帶用脫脂牛奶封閉,隨后將硝酸纖維素膜和一抗以及二抗孵育。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影,最終用ImageJ軟件定量條帶灰度值。

1.9雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體WT-circ_0001658、MUT-circ_0001658,依據(jù)商業(yè)化的試劑盒說(shuō)明分析熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1circ_0001658在乳腺癌組織中表達(dá):circ_0001658和miR-1179在癌旁組織組織中的表達(dá)量分別是1.00±0.11和1.00±0.10,在乳腺癌組織中的表達(dá)量分別是4.24±0.53和0.45±0.05,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 circ_0001658和miR-1179在乳腺癌組織中定量分析

2.2沉默circ_0001658對(duì)BT-549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響:如圖1、表2和表3所示,與si-NC組比較,si-circ_0001658組BT-549細(xì)胞中circ_0001658表達(dá)降低,細(xì)胞OD值、S期細(xì)胞比例以及PCNA、CyclinD1、Bcl-2產(chǎn)生減少,G0-G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率以及p27、Bax產(chǎn)生增加(P<0.05)。

圖1 沉默circ_0001658對(duì)BT-549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表2 沉默circ_0001658對(duì)BT-549細(xì)胞增殖細(xì)胞周期和凋亡的影響

表3 沉默circ_0001658對(duì)BT-549細(xì)胞增殖細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3circ_0001658靶向miR-1179:Circ_0001658含有miR-1179互補(bǔ)的核苷酸序列(圖2)。結(jié)果展示相對(duì)熒光素酶活性值在WT-circ_0001658和miR-NC轉(zhuǎn)染組、WT-circ_0001658和miR-1179轉(zhuǎn)染組、MUT-circ_0001658和miR-NC轉(zhuǎn)染組和MUT-circ_0001658和miR-1179轉(zhuǎn)染組分別是1.01±0.12、0.43±0.05、1.02±0.10和1.00±0.08(表4、表5),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 circ_0001658含有miR-1179互補(bǔ)序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 circ_0001658調(diào)控miR-1179表達(dá)

2.4過(guò)表達(dá)miR-1179對(duì)BT-549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響:與miR-NC組比較,miR-1179組BT-549細(xì)胞中miR-1179表達(dá)升高,細(xì)胞OD值、S期細(xì)胞比例以及PCNA、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低,G0-G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率以及p27、Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖3、表6和表7)。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-1179對(duì)BT-549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響

表6 過(guò)表達(dá)miR-1179對(duì)BT-549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響

表7 過(guò)表達(dá)miR-1179對(duì)BT-549細(xì)胞增殖細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5下調(diào)miR-1179逆轉(zhuǎn)了沉默circ_0001658對(duì)BT-549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響:如圖4、表8和表9所示,與si-circ_0001658+anti-miR-NC組比較,si-circ_0001658+anti-miR-1179組BT-549細(xì)胞中miR-1179表達(dá)下降,細(xì)胞OD值、S期細(xì)胞比例以及PCNA、CyclinD1、Bcl-2產(chǎn)生增加,G0-G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率以及p27、Bax產(chǎn)生減少(P<0.05)。

圖4 下調(diào)miR-1179逆轉(zhuǎn)了沉默circ_0001658對(duì)BT-549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響

表8 下調(diào)miR-1179逆轉(zhuǎn)了沉默circ_0001658對(duì)BT-549細(xì)胞增殖細(xì)胞周期和凋亡的影響

表9 抑制miR-1179表達(dá)挽救了circ_0001658低表達(dá)對(duì)BT-549細(xì)胞增殖細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn),circRNA的異常高表達(dá)與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)。在乳腺癌組織和細(xì)胞中,circ_0103552表達(dá)上調(diào),上調(diào)circ_0103552可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,而敲減circ_0103552則誘導(dǎo)了相反的效應(yīng)[5]。circCD44在三陰性乳腺癌中高表達(dá),其表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān),circCD44可促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及腫瘤發(fā)生[6]。Circ_0000517低表達(dá)能夠減少乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[7]。Circ-RPPH1敲低減弱乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。下調(diào)circ_0000514可抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。敲減circ_0068631可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。circ_0088088在乳腺癌中表達(dá)上調(diào),其高表達(dá)表示不良預(yù)后,上調(diào)hsa_circ_0088088可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[9]。circ-PDCD11可加速三陰性乳腺癌細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳酸生成、ATP生成和細(xì)胞外酸化速率[10]。當(dāng)前的研究結(jié)果顯示乳腺癌組織中circ_0001658表達(dá)增加,circ_0001658敲低降低了BT-549細(xì)胞OD值、S期細(xì)胞比例以及PCNA、CyclinD1、Bcl-2蛋白水平,升高了G0-G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率以及p27、Bax蛋白水平,提示沉默circ_0001658可抑制BT-549細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示circ_0001658能以競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA的角色介導(dǎo)microRNA和其下游基因表達(dá)[2,3]。當(dāng)前的結(jié)果表明circ_0001658與miR-1179之間存在互補(bǔ)序列,且circ_0001658負(fù)調(diào)控miR-1179表達(dá)。相關(guān)數(shù)據(jù)已指出miR-1179在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。如miR-1179過(guò)表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲[11]。miR-1179通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)MEK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路抑制口腔癌細(xì)胞增殖和提高長(zhǎng)春新堿敏感性[12]。miR-1179在胃癌組織和細(xì)胞系中均顯著下調(diào),其表達(dá)降低與胃癌患者的腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),過(guò)表達(dá)miR-1179可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。miR-1179通過(guò)靶向SPAG5和抑制Akt信號(hào)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[14]。miR-1179通過(guò)靶向E2F5抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-1179在膠質(zhì)瘤中低表達(dá),上調(diào)miR-1179可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程[15]。和這些數(shù)據(jù)類(lèi)似,乳腺癌組織中miR-1179表達(dá)降低,miR-1179降低了BT-549細(xì)胞OD值、S期細(xì)胞比例以及PCNA、CyclinD1、Bcl-2蛋白水平,升高了G0-G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率以及p27、Bax蛋白水平,提示過(guò)表達(dá)miR-1179可抑制BT-549細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;miR-1179抑制劑挽救circ_0001658敲低對(duì)BT-549細(xì)胞表型的影響,BT-549細(xì)胞OD值、S期細(xì)胞比例以及PCNA、CyclinD1、Bcl-2蛋白水平升高,G0-G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率以及p27、Bax蛋白水平降低,以上結(jié)果說(shuō)明了circ_0001658通過(guò)靶標(biāo)miR-1179介導(dǎo)BT-549細(xì)胞表型變化。

綜上所述,抑制circ_0001658表達(dá)通過(guò)靶向miR-1179抑制BT-549細(xì)胞腫瘤特性。circ_0001658可能是乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn),但僅限于體外實(shí)驗(yàn),circ_0001658在體內(nèi)的作用還有待進(jìn)一步研究。