SFRP1通過MAPK信號通路對牙髓干細胞活性及血管生成的機制研究

車藝蕾, 方 璘

(航天中心醫院口腔科, 北京 100049)

疾病和創傷是導致牙本質或牙槽骨缺損的主要成因之一,其嚴重影響了患者的生活質量。構建牙本質/骨組織再生治療系統已成為組織工程和再生醫學領域的研究熱點。隨著時代的不斷發展,利用具有強分化潛能的干細胞進行組織修復工程技術已有望應用于修復受損的組織或器官。間充質干細胞(MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞[1],因此,基于間充質干細胞的組織修復療法已被考慮用于受損組織的修復當中[2]。MSCs可以從多種來源中分離出來,如骨髓、外周血、牙組織和胎盤之中[3]。但與其它來源的間充質干細胞相比,牙組織來源的干細胞具有更為便捷的優勢,其被認為是組織工程和再生醫學的重要來源之一。牙髓干細胞(DPSC)是一種從牙髓組織中分離,來源于過渡神經坩堝細胞的牙源性間充質干細胞,并已被證明具有分化成骨細胞、成軟骨細胞、成神經細胞、成纖維細胞、血管細胞、內皮細胞、周細胞樣細胞、平滑肌樣細胞和內耳毛細胞的能力[4～6]。在適當的微環境下,牙髓干細胞可作為種子細胞分化成成牙本質細胞,再生牙髓牙本質復合體,有助于牙齒修復、牙根再生,甚至可以通過其利用組織工程方法進行功能性牙齒再生[7]。DPSCs已經顯示出與礦化形成相關的特異性表面標記和基質蛋白,其類似于眾所周知的骨髓間充質干細胞(BMSCs)。然而,這些干細胞的生長及分化通常依賴于生長因子的參與。分泌性Frizzled相關蛋白-1(SFRP1)被表明在牙齒形成期間發揮了重要作用[8],但其在牙髓干細胞的中鮮有研究,尚不清楚其是否可以調節牙髓干細胞的細胞生物學功能,故而我們以此為研究對象,在牙髓干細胞中探究其是否能發揮調節作用,以期為最終為臨床上進行組織學修復等引用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1細胞培養與處理:研究所使用的人源牙髓干細胞(DPSC)購自上海華雅思創科技有限公司,細胞培養于含10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)中,在37℃和5% CO2條件下培養和進行傳代。將對數生長期的DPSC細胞分別接種在6孔板中(2×105/孔)。孵育24h后,使用LiPofectamine 2000(11668-019,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分別將si-NC、si-SFRP1(Shanghai Genechem Co.,Ltd.,Shanghai,China)(si-RNA 50 nM)分別轉染到細胞中,操作按照說明書進行。轉染48h后進行后續實驗。

1.2Quantitative Real-time PCR檢測SFRP1 mRNA水平:按照說明書,使用Trizol試劑(Invitrogen)從培養的細胞中分離出總RNA。用PrimerScript RT Master Mix(Takara,Dalian,China)將1 μg RNA反轉錄為cDNA。然后根據說明書用SYBR Premix Ex Taq(Takara,Dalian,China)在 ABI 7500(ABI,American)上進行qRT-PCR實驗,GAPDH作為內參,通過2-△△Ct法分別計算基因的相對表達量。PCR引物見表1。

表1 引物序列

1.3Westernbolt檢測蛋白表達水平:提取各樣品蛋白,按BCA蛋白質測定試劑盒(Thermo Scientific Pierce)說明書測定蛋白質濃度,將提取的蛋白加入上樣緩沖液后再95℃煮10min,每個蛋白樣本分別取30 μg經聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE,10%(w/v))電泳,電泳電壓80v轉120v,濕轉,轉膜電壓100mv,時間45～70min,PVDF轉膜,5% BSA室溫封閉1h,4℃與一抗孵育過夜。TBST漂洗3次,辣根過氧化物酶結合的二抗IgG,常溫孵育1h,TBST充分洗滌后以ECL法顯色,Bio-OAdGelEZ成像儀(Bio-OAd,California,USA)顯影。目的條帶采用Image J軟件(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland,USA)進行灰度值分析。一抗:SFRP1(1∶1000,ab126613,Abcam,UK)、p-p38(1∶1000,ab178867,Abcam,UK)、p38(1∶1000,ab170099,Abcam,UK)、actin(1∶1000,ab8227,Abcam,UK)、GAPDH(1∶1000,ab9485,Abcam,UK);二抗:羊抗兔IgG(1∶5000,ab6721,Abcam,UK)

1.4CCK-8檢測細胞增殖活力:將細胞接種到96孔板中(每孔3×103個細胞)并在37℃下培養。分別培養0h、24h、48h和72h后,向每個孔中加入10μLCCK-8反應試劑(Beyotime Institute of Biotechnology,Haimen,China)。37℃孵育4h后,檢測450 nm處的吸光度,繪制細胞增殖曲線。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡:調整細胞濃度為2×105細胞/孔,接種至6孔板中,24h后根據后續實驗需求進行處理。調整細胞濃度為5×105細胞/mL,加入5μL Annexin V-APC and 5μL 7-AAD,在室溫避光孵育15min,用流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.6細胞劃痕實驗檢測細胞遷移:將細胞以5×105個/孔接種于6孔板中,培養至達到融合。如上述處理方法處理細胞后,使用1000L無菌微量移液器吸頭在每孔的細胞層中心下方劃痕。然后用PBS清洗細胞兩次,并在不含胎牛血清的培養基中培養。在劃痕后0、24h于明視場顯微鏡(Olympus,Japan)下每組采集3個隨機獨立視野圖像。使用ImageJ軟件(v1.52a;National Institutes of Health)對劃痕的寬度進行定量測量,并計算遷移率。

1.7血管形成實驗檢測血管形成能力:向24孔板中加入100L液化Matrigel(Becton,Dickinson and Company),將平板置于37℃下,直至Matrigel凝固。然后,將上述細胞接種于24孔板中。8h后,使用明視場顯微鏡觀察DPSC的管狀形成。使用ImageJ軟件(v1.52a; National Institutes of Health)對血管的分支數及長度進行量化。

2 結 果

2.1敲低SFRP1表達水平抑制牙髓干細胞增殖活性:為了探究SFRP1對牙髓干細胞活性的影響,我們首先通過si-SFRP1敲低牙髓干細胞的表達,qRT-PCR與Westernblot檢測si-SFRP1的敲降效率,我們成功敲降了牙髓干細胞中SFRP1的表達(圖1A、B,均P<0.01)。接下來,采用CCK-8與流式細胞術檢測細胞的增殖活力與凋亡情況,我們觀察到si-SFRP1組較si-NC組細胞增殖活力顯著下降,凋亡則顯著增加(圖1C、D,均P<0.01)。以上結果說明,敲低SFRP1表達水平可以抑制牙髓干細胞的增殖活性。

圖1 敲低SFRP1抑制牙髓干細胞的活性

2.2敲低SFRP1抑制牙髓干細胞的血管形成能力:為了進一步探究SFRP1對牙髓干細胞的細胞功能學影響,我們對各組細胞進行了細胞劃痕能力檢測以及血管形成能力檢測,我們觀察到si-SFRP1組較si-NC組DPSC細胞遷移能力顯著下降,同時形成的管狀結構分支點數目也顯著減少(圖2A、B,均P<0.01)。以上結果說明,敲低SFRP1可以損害牙髓干細胞的遷移及血管形成能力。

圖2 敲低SFRP1抑制牙髓干細胞的血管形成能力

2.3敲低SFRP1通過MAPK信號通路抑制牙髓干細胞:我們推測,敲低SFRP1對牙髓干細胞的影響是通過MAPK信號通路作用的。為了驗證這一猜想,我們通過Westernblot檢測了各組細胞的MAPK信號通路關鍵蛋白p-p38與p38,觀察到si-SFRP1組較si-NC組p38的磷酸化顯著減少(圖3,P<0.01)。綜上所述,表明敲低SFRP1通過失活MAPK信號通路抑制牙髓干細胞的活性及血管生成能力。

圖3 MAPK信號通路活性

3 討 論

骨缺損及其相關疾病不會直接影響人類的生存,但會嚴重影響人類的生活質量,降低生活的幸福感。迄今為止,骨再生仍然是醫學中的一個重要挑戰,尤其是在整形外科和口腔頜面外科中。近年來,受益于仿生學,用于骨組織再生的新型材料和支架已經被開發出來。骨組織工程涉及多個步驟,例如,將具有骨誘導分子的細胞摻入支架并在體外進行預培養,然后將負載細胞的支架植入骨缺損區域。在這些步驟中,選擇合適的細胞和骨誘導分子至關重要,間充質干細胞被認為是用于組織修復的較好來源。據報道,負載DPSC的支架能夠促使骨再生,由此可見探究DPSC的分子調控機制的重要性。

SFRP1在細胞凋亡調節中發揮顯著作用,本研究通過si-SFRP1敲低牙髓干細胞的表達,敲低SFRP1后,牙髓干細胞凋亡率上升。SFRP1的刪除或沉默涉及表觀遺傳和其他機制,并參與生物行為,如細胞增殖、遷移等,本研究同樣觀察到了這一點。MAPK是一種Ser/Thr蛋白激酶,存在于大多數細胞中,并負責將細胞外信號分子轉導到細胞核中。在細胞增殖、分化和其他活動中起重要的調節作用。MAPK主要包括ERK、p38和C-JNK信號通路。MAPK家族中的經典通路,p38 MAPK信號通路參與各種應激反應和炎癥因子的信號轉導。p38 MAPK已經成為炎癥和癌癥預防和治療的重要潛在靶點。在前牙本質向次級牙本質的發育過程中,p38 MAPK通路的調節對成牙本質細胞的分泌活動至關重要。還有報道表明在抑制p38 MAPK信號通路后,堿性磷酸酶和OCN的表達顯著減少。

本研究首次觀察到SFRP1敲低后可以影響MAPK信號通路中p38的磷酸化,同時影響牙髓干細胞的增殖活力、凋亡、遷移與血管形成能力。證明了SFRP1與MAPK在牙髓干細胞中具有分子調控機制。但本研究僅從p38 MAPK通路入手,并未探究ERK1/2是否也發揮了調控作用,同時并未進一步探究SFRP1是否具有調節牙髓干細胞分化的能力,在未來,我們將進一步對這些方面進行探究,以期在臨床上為組織器官修復和移植提供完整的理論依據。