三七白及粉通過Nrf2/Gpx4介導(dǎo)的鐵死亡改善腦出血型應(yīng)激性潰瘍大鼠的胃黏膜損傷

安 凱, 郭沛然, 孫玉鳳

(1.河北省石家莊市人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)二病區(qū), 河北 石家莊 050000 2.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院, 河北 石家莊 050000 3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科, 河北 石家莊 050000)

應(yīng)激性胃潰瘍(stress gastric ulcer,SGU)是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下所出現(xiàn)的一種急性胃黏膜病變,臨床上常見癥狀為胃底、胃體部的黏膜表淺潰瘍、糜爛或出血[1]。SGU是急危重患者常見的并發(fā)癥之一,統(tǒng)計顯示,有85%以上的重癥患者均出現(xiàn)了應(yīng)激性胃潰瘍,其中出血患者占6%～20%。目前顱腦疾病所致的SGU在臨床最為常見,研究發(fā)現(xiàn)[2],腦出血后機(jī)體會產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng),如神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫和代謝等,這些應(yīng)激反應(yīng)通過作用于下丘腦而促進(jìn)胃泌素及胃酸的分泌,加重胃黏膜屏障功能損害,最終發(fā)展為SGU。臨床常用H2受體拮抗劑或質(zhì)子泵抑制劑方法治療SGU,但臨床效果并不理想,近年來中藥治療SGU消化道出血療效顯著。三七具有多種功效,包括活血、祛瘀、鎮(zhèn)痛、消腫、補(bǔ)虛強(qiáng)壯等,進(jìn)而發(fā)揮對潰瘍面少量滲血的抑制作用,對潰瘍組織微循環(huán)的改善作用,對壞死組織和炎性水腫吸收的促進(jìn)作用。白及在中藥中是止血、生肌的常用藥物,其具有一定的高黏性,通過在胃內(nèi)形成較厚的膜狀物而粘在潰瘍面,從而抑制胃蛋白酶、胃酸等對潰瘍組織的侵襲,最終對潰瘍面的愈合發(fā)揮促進(jìn)作用。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥方劑中,三七白及粉常見于具有活血化瘀、止血、消腫等功效的復(fù)方中,其已有研究證實在抗凝血、抗血小板聚集、促進(jìn)血管新生等方面具有重要作用[3]。有學(xué)者研究證實[4],三七白及粉類方劑聯(lián)合西藥治療消化性潰瘍的效果優(yōu)于單用西藥治療。但目前關(guān)于三七白及粉作用于SGU的機(jī)制尚不清楚。鐵死亡是一種新的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式,其在臨床上常以鐵過載和脂質(zhì)過氧化物累積為主要特征[5]。在鐵死亡過程中,核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,Gpx4)是關(guān)鍵調(diào)控因子之一,Nrf2和Gpx4的缺失會通過異常的鐵代謝和脂質(zhì)過氧化等導(dǎo)致細(xì)胞死亡,其中胃黏膜細(xì)胞在胃潰瘍疾病中能夠起到修復(fù)損傷胃黏膜作用[6],因此推測Nrf2/Gpx4通路介導(dǎo)的鐵死亡與SGU疾病密切相關(guān)。因此本研究從Nrf2/Gpx4通路介導(dǎo)的鐵死亡的基礎(chǔ)上,探究三七白及粉對腦出血型SGU大鼠胃黏膜損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物:SPF級雄性SD大鼠均購自杭州師范大學(xué),共計60只,體質(zhì)量200g～220g,生產(chǎn)許可證號SCXK(浙)2021-0004。統(tǒng)一飼養(yǎng)大鼠,動物房內(nèi)保持室溫23℃～25℃,相對濕度50%～60%,保證房間光照12h一循環(huán),晝夜交替。自由攝食飲水。

1.2試劑和儀器:Nrf2特異性抑制劑ML385(美國MedChem Express公司);亞鐵離子(Fe2+)檢測試劑盒(深圳邁德施生物科技股份有限公司);Nrf2、SLC7A11、Gpx4抗體(武漢艾美捷科技有限公司);多聚甲醛(濟(jì)南翱翔化工有限公司);蘇木精-伊紅染色液(北京百奧萊博有限公司);雙目立體解剖顯微鏡(儀景通光學(xué)科技(上海)有限公司);TGL-16G-A低溫高速離心機(jī)(青島精誠儀器儀表有限公司)。

1.3藥物配制:在研缽中研磨中藥三七和白及成粉末狀,依據(jù)比例量取并調(diào)均藥粉;根據(jù)人和動物體藥物換算折算所用藥量。按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為NC組、SGU組、三七白及粉低劑量組(三七白及粉L組)、三七白及粉中劑量組(三七白及粉M組)、三七白及粉高劑量組(三七白及粉H組)、三七白及粉高劑量+Nrf2特異性抑制劑ML385組(三七白及粉H+ML385組),每組10只。制備自體血基底節(jié)出血大鼠模型,麻醉大鼠,仰臥位固定大鼠于操作臺,去除頭頂部的毛發(fā)后置于腦立體定位儀上,沿顱頂中線右側(cè)0.5cm眼耳連接線處切開1cm小口,將顱骨皮下筋膜鈍性分離。在前鹵0.2mm、正中旁開3mm處定位后用顱鉆打一直徑為1mm的孔。分別抽取各組大鼠200μL尾靜脈自體血,立即從顱頂開孔出垂直進(jìn)針6mm,將自體血用微量泵入右腦基底節(jié)內(nèi),平分每分鐘泵入5μL。自體血泵入完畢,10min后緩慢拔針。逐層縫合皮膚,傷口處涂抹碘伏消毒。NC組大鼠僅在顱頂鉆孔不泵入自體血,其余步驟同其他各組相同。神經(jīng)功能評分2分以上,且肉眼可見大鼠胃黏膜充血、水腫、潮紅,胃體部出現(xiàn)多處斑點狀糜爛、潰瘍及出血,組織病理可見胃黏膜炎細(xì)胞浸潤、黏膜損傷為造模成功。

1.4給藥:術(shù)后3d后給藥干預(yù),三七白及粉L組、三七白及粉M組、三七白及粉H組大鼠分別灌胃給藥2.5g/kg、5.0g/kg、10g/kg的三七白及粉,劑量為1mL/100g;三七白及粉H+ML385組大鼠灌胃10g/kg的三七白及粉,同時腹腔注射DMSO溶解稀釋的Nrf2特異性抑制劑ML385 30mg/kg;NC組和SGU組分別給予等量的生理鹽水灌胃,1次/日。各組大鼠均連續(xù)灌胃14d。

1.5神經(jīng)功能評分[7]:在腦出血模型制備6h后,使用LongaFZ法進(jìn)行神經(jīng)功能評分,2分以上為模型制備成功,評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 神經(jīng)功能評分

1.6胃黏膜潰瘍指數(shù)(ulcer index,UI)測定:麻醉并處死大鼠,以1%甲醛溶液灌胃提取整個胃組織,將胃組織固定于1%甲醛溶液中,10min后取出沿胃大彎將整個胃部切開,沖洗胃內(nèi)容物后鋪平,用立體顯微鏡用目鏡測微尺測量胃黏膜損傷長度,計算胃黏膜損傷指數(shù),UI=胃黏膜各處糜爛分值相加的總和,當(dāng)損傷寬度>1mm時計分按2倍計算,評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 胃黏膜損傷指數(shù)(UI)評分

1.7HE染色檢測胃組織病理學(xué)變化:UI測量后,將胃組織固定于4%多聚甲醛溶液,包埋盒包埋后流水沖洗固定液,不同濃度酒精脫水組織后置于二甲苯中,將透明的組織用石蠟包埋,用切片機(jī)切成厚度為5μm的薄片,用蘇木精水溶液染色切片,蒸餾水沖洗后酒精脫水,將切片用伊紅染色3min,將切片置于顯微鏡下觀察。

1.8檢測胃組織中Fe2+、MDA含量及SOD活性:切取胃黏膜組織并稱取重量,將生理鹽水按照1∶9的比例加入胃黏膜組織中,用研磨機(jī)研磨至組織均漿,離心機(jī)3000r/min速度離心,10min后收集上清液,用BCA法對上清液中總蛋白的濃度進(jìn)行測定。按照試劑盒說明書分別分量上清液中Fe2+濃度、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。

1.9DHE熒光染色法檢測胃組織中ROS水平:將胃組織于冰箱中冷凍,取出后切片機(jī)切片,將10μmoL/L的HDE加入到切片中,在避光的環(huán)境中,37℃孵育30min,洗滌切片后封片。將切片置于顯微鏡下觀察DHE染色的熒光強(qiáng)度,熒光度越高代表ROS含量越高,最后用軟件分析各組大鼠胃組織中ROS水平。

1.10蛋白質(zhì)印跡檢測胃黏膜組織中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表達(dá):收集胃黏膜組織,提取組織中總蛋白,DAB法檢測蛋白濃度。配置等濃度蛋白溶液為2μg/mL,按照6∶1的比例加入相應(yīng)的體積的,煮沸溶液10min后保存蛋白溶液于-20℃的冰箱。取蛋白樣品30μg,電泳蛋白樣品后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,加入5%的脫脂奶粉到PVDF膜上,封閉PVDF膜1h,分別加入一抗Nrf2、Gpx4和SLC7A11(1∶1000),在4℃環(huán)境中孵育一抗過夜,后清洗PVDF膜,加入相應(yīng)的二抗(1∶1000),室溫孵育二抗2h。將ECL發(fā)光劑加入到細(xì)胞中曝光,用顯影液顯影,用Image Lab軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能評分:與NC組相比,SGU組大鼠神經(jīng)功能評分明顯增加(P<0.05);與SGU組相比,三七白及粉L、M、H組大鼠神經(jīng)功能評分均明顯降低,且呈劑量依賴(P<0.05);與三七白及粉H組相比,三七白及粉H+ML385組大鼠神經(jīng)功能評分明顯升高(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

2.2各組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)比較:NC組大鼠胃黏膜光滑,胃皺襞完整,且未見出血及糜爛狀,UI為0分;SGU組胃黏膜損傷嚴(yán)重,表面有大量的深色物質(zhì)堆積,且可見充血水腫,黏膜皺襞可多處出血(點狀/線狀),甚至有部分的皺襞凹陷,甚至有皺襞中斷,UI明顯升高;三七白及粉L、M、H組胃黏膜損傷程度明顯輕度SGU組,水腫程度逐漸減輕、出血數(shù)量逐漸減少,UI明顯低于SGU組,且呈劑量依賴(P<0.05);三七白及粉H+ML385組胃黏膜損傷程度和SGU組相似,UI明顯高于三七白及粉H組(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較

2.3各組大鼠胃組織病理學(xué)變化比較:NC組大鼠胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)清晰,黏膜腺體均整齊排列,為未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤;SGU組大鼠胃黏膜明顯損傷,黏膜下可見充血水腫,且有大量的炎性細(xì)胞浸潤,黏膜上皮細(xì)胞大量壞死,深層黏膜被明顯破壞;三七白及粉L、M、H組胃黏膜下層水腫充血程度較SGU組明顯減輕,炎性浸潤較SGU組也明顯減少,且呈劑量依賴;三七白及粉H+ML385組胃黏膜損傷程度較三七白及粉H組明顯加重,和SGU組相似(圖3)。

圖3 大鼠胃組織病理學(xué)變化(HE染色,×200)

2.4各組大鼠胃組織中Fe2+、MDA含量及SOD活性比較:和NC組相比,SGU組大鼠胃組織中Fe2+、MDA含量升高,SOD活性降低(P<0.05);和SGU組相比,三七白及粉L、M、H組大鼠胃組織中Fe2+、MDA含量降低,SOD活性升高。且呈劑量依賴(P<0.05);和三七白及粉H組相比,三七白及粉H+ML385組胃組織中Fe2+、MDA含量升高,SOD活性降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組大鼠胃組織中Fe2+、MDA含量及SOD活性比較

2.5各組大鼠胃組織中ROS水平比較:與NC組相比,SGU組大鼠胃組織中ROS水平明顯升高(P<0.05);與SGU組相比,三七白及粉L、M、H組大鼠胃組織中ROS水平均明顯降低,且呈濃度依賴(P<0.05);與三七白及粉H組相比,三七白及粉H+ML385組大鼠胃組織中ROS水平明顯升高(P>0.05)(圖5)。

圖5 各組大鼠胃組織中ROS水平比較

2.6各組大鼠胃黏膜組織中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表達(dá)比較:和NC組相比,SGU組大鼠胃黏膜組織中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);和SGU組相比,三七白及粉L、M、H組大鼠胃黏膜組織中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表達(dá)均明顯增加,且呈劑量依賴(P<0.05);三七白及粉H+ML385組大鼠胃黏膜組織中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表達(dá)明顯低于三七白及粉H組(P<0.05)(圖6)。

圖6 各組大鼠胃黏膜組織中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表達(dá)比較

3 討 論

腦出血是常見的神經(jīng)系統(tǒng)病變,其導(dǎo)致的消化道出血是最常見的并發(fā)癥。腦出血型應(yīng)激性潰瘍在臨床上又被稱為Cushing潰瘍,常以急性的胃黏膜病變、糜爛性胃炎、出血性胃炎、消化道潰瘍等癥狀為主要表現(xiàn)[8]。SGU在臨床通常發(fā)病隱匿且無明顯癥狀,患者如沒有相關(guān)潰瘍性疾病的病史,患者極易因上消化道出血、胃腸穿孔等因素導(dǎo)致死亡,對危重患者的健康及生命造成嚴(yán)重的威脅[9]。成功的制備動物模型可較好的模擬出人腦出血型SGU相似的病理特征,對腦出血型應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后尤為重要,對研究相對有效的治療藥物有重要意義[10]。本研究通過制備腦出血型應(yīng)激性胃潰瘍模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGU組大鼠神經(jīng)功能評分和胃潰瘍指數(shù)均明顯增加,且經(jīng)胃組織大體觀察及HE染色證實以上結(jié)果,提示模型制備成功。因此,本研究通過對腦出血型應(yīng)激性潰瘍大鼠干預(yù)來探究有效的治療方法。

我國中醫(yī)中并無應(yīng)激性潰瘍名稱,通常稱為胃痛和血癥。機(jī)體中血液生于肝臟,但又藏受在肝中,總統(tǒng)在心臟,輸布在肺部,化精在腎臟,脈為血之府。如因郁怒傷到肝臟,肝氣會橫逆到胃部,熱入血分且損傷血絡(luò),最后導(dǎo)致吐血。因此在治療時應(yīng)遵循“適宜行血但不能止血,適宜補(bǔ)肝但不能伐肝,適宜降氣但不能降火”的宗旨,治療時應(yīng)從宣暢氣機(jī)己達(dá)郁陽,疏肝暢脾以復(fù)升降立法。三七性溫、味甘味苦,可入肝經(jīng)血分,即能功善止血又能化瘀生新,同時具有止血不留瘀且化瘀不傷正的功效。如將三七和白及聯(lián)合使用可起到收斂止血,治標(biāo)又治本的功效。本研究采用不同濃度的三七白及粉干預(yù)SGU大鼠,結(jié)果顯示三七白及粉L、M、H組大鼠神經(jīng)功能評分、胃潰瘍指數(shù)均明顯降低,胃組織潰瘍得到明顯改善,且隨著三七白及粉濃度的增加效果越顯著,提示三七白及粉可對腦出血型應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜發(fā)揮保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn),胃黏膜組織生物膜脂質(zhì)中含有大量的不飽和脂肪酸,氧自由基可損傷細(xì)胞,通過和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致胃黏膜屏障內(nèi)平衡系統(tǒng)功能紊亂[11]。MDA為膜脂質(zhì)過氧化物分解的產(chǎn)物之一,其能對胃黏膜組織的脂質(zhì)過氧化程度進(jìn)行反應(yīng),進(jìn)而被臨床用于反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度[12]。SOD是存在于生物體內(nèi)的一種酶類,其能通過清除機(jī)體在代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),而抑制和防御自由基損傷[13]。SOD活性程度可對機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的能力很好的反應(yīng),通常被認(rèn)為是抗氧化能力的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示,SGU組大鼠胃組織中MDA含量升高、SOD活性降低,三七白及粉L、M、H組MDA含量降低、SOD活性升高,且呈劑量依賴。提示三七白及粉可增強(qiáng)胃黏膜組織的抗氧化能力,進(jìn)而對胃黏膜組織發(fā)揮保護(hù)作用。Fagundes等研究證實,胃組織中氧自由基的清除,及胃黏膜組織中的抗氧化能力和應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

鐵死亡是指Fe2+和脂質(zhì)活性氧依賴的非凋亡程序性死亡,其在臨床上常以還原性鐵激活、含不飽和脂肪酸磷脂過氧化及脂質(zhì)過氧化修復(fù)受損等為主要特征。在腦出血發(fā)生后,血液中的紅細(xì)胞會破裂釋放出大量的血紅蛋白,并釋放出大量的游離鐵。這些游離鐵可以觸發(fā)Fenton反應(yīng),在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基,導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷,最終促進(jìn)應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生。本文通過檢測發(fā)現(xiàn),SGU組Fe2+和ROS含量高于NC組,說明有嚴(yán)重的氧化損傷,且Fe2+可作為催化劑調(diào)節(jié)氧化還原平衡過程,提示鐵死亡可能參與腦出血型應(yīng)激性潰瘍的進(jìn)程。

Nrf2/Gpx4途徑是一種細(xì)胞內(nèi)鐵代謝調(diào)節(jié)的重要機(jī)制,與鐵相關(guān)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡過程有密切關(guān)聯(lián)。Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子,其可調(diào)控Gpx4、SLC7A11等促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)答,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。SLC7A11是一種關(guān)鍵的鐵死亡調(diào)節(jié)劑,其能維持氧化還原的穩(wěn)定狀態(tài),進(jìn)而對鐵死亡發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。Gpx4是一種抗氧化酶,它能夠降解細(xì)胞內(nèi)的過氧化脂質(zhì),減輕氧化應(yīng)激的損害。腦出血會引起局部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵儲存蛋白的釋放,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的氧化損傷和細(xì)胞死亡。Nrf2/Gpx4途徑的激活可以抑制鐵的釋放和氧化應(yīng)激反應(yīng),從而減輕腦出血后鐵相關(guān)的細(xì)胞死亡。因此猜測,Nrf2/Gpx4途徑在腦出血型應(yīng)激性潰瘍中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示,SGU組胃黏膜組織中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表達(dá)明顯降低,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡,引發(fā)細(xì)胞死亡。通過三七白及粉干預(yù)后Fe2+及ROS含量明顯降低,胃黏膜組織中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表達(dá)明顯增加,提示可能通過激活Nrf2/Gpx4通路抑制鐵死亡,緩解氧化損傷,進(jìn)而對腦出血型應(yīng)激性潰瘍胃黏膜損傷發(fā)揮保護(hù)作用。為了驗證這一猜測,本研究將高劑量的三七白及粉和Nrf2抑制劑ML385聯(lián)合干預(yù)大鼠,結(jié)果顯示三ML835能減弱三七白及粉對腦出血型SGU大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)作用,進(jìn)一步證實三七白及粉可能通過激活Nrf2/Gpx4通路抑制鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述,三七白及粉對腦出血型應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜損傷發(fā)揮保護(hù)作用,其機(jī)制和激活Nrf2/Gpx4通路抑制鐵死亡相關(guān)。