HPV感染與宮頸病變患者免疫調(diào)節(jié)失衡及細(xì)胞異常增殖狀態(tài)的相關(guān)性

侯 穎, 李艷梅, 李秀蘭, 劉 青

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院婦科, 北京 100069)

人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一種引起皮膚和黏膜上皮增生的病毒,其主要癥狀包括尋常疣和生殖器疣[1]。宮頸病變是宮頸區(qū)域出現(xiàn)的炎癥、損傷和腫瘤等病變[2]。HPV持續(xù)感染與宮頸病變的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),因?yàn)橄嚓P(guān)基因產(chǎn)物會(huì)干擾細(xì)胞周期的正常調(diào)節(jié),導(dǎo)致細(xì)胞不斷增殖,可能導(dǎo)致病情惡化。此外,不同類型的HPV具有不同的危險(xiǎn)程度和危害程度。目前研究發(fā)現(xiàn)宮頸病變發(fā)生的直接原因是HPV導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂及細(xì)胞異常增殖[3],通過(guò)改變宮頸組織的免疫環(huán)境,刺激細(xì)胞無(wú)限增殖,但具體機(jī)制尚未明確。故本研究探討HPV感染與宮頸病變患者免疫調(diào)節(jié)失衡及細(xì)胞異常增殖狀態(tài)的關(guān)系,旨在了解該病患者機(jī)體免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞功能變化,為宮頸病變的臨床治療提供有效的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2020年1月至2022年4月在我院治療的高危HPV感染宮頸病變患者56例(高危HPV組,高危HPV指HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型等),低危HPV感染宮頸病變患者51例(低危HPV組,低危HPV指HPV6、11、40、42、43、44、54、61、72、81、89型等),HPV陰性宮頸病變患者57例(HPV陰性組),納入標(biāo)準(zhǔn):①宮頸病變均經(jīng)病理學(xué)確診CINⅠ級(jí)病變及以上;②既往無(wú)宮頸治療史;③初次就診者;④患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者、肝腎功能障礙、自身免疫系統(tǒng)疾病等其他嚴(yán)重疾病;②近3個(gè)月有全身感染性疾病者。同時(shí)選取健康體檢女性60例(正常組),納入標(biāo)準(zhǔn):①無(wú)宮頸病變及宮頸治療史;②受試者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者、肝腎功能障礙、自身免疫系統(tǒng)疾病等其他嚴(yán)重疾病;②近3個(gè)月有全身感染性疾病者。各組受試者臨床一般資料比較見(jiàn)表1,具有可比性。

表1 各組臨床一般資料比較

1.2檢查方法

1.2.1外周血免疫指標(biāo)檢測(cè):入院后采集患者外周空腹靜脈血10mL 2管,1管1000×g離心10min,取上層血清,-20℃冰箱保存,采用免疫濁度法檢測(cè)IgA、IgG、IgM水平(試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾生物科技公司)。另1管采用BD FACSCelestaTM流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD3+、CD4+、CD8+百分比。

1.2.2細(xì)胞因子檢測(cè):入組即刻,獲取患者宮頸組織標(biāo)本,碾磨后加入PBS液、1000×g離心10min,取上清液,酶聯(lián)免疫法檢測(cè)外周血細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-17、TGF-β水平(試劑盒選自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè):檢查或術(shù)后,采集病變組織標(biāo)本,甲醛固定,石蠟包埋后制作切片,進(jìn)行p16、Ki67染色,免疫組織化學(xué)染色采用SP法處理。

1.2.4增殖基因表達(dá)量檢測(cè):檢查中采取可疑病灶區(qū)域?qū)m頸組織標(biāo)本,應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)并計(jì)算增殖相關(guān)基因Prdx4和STAT3mRNA表達(dá)量。(選自美國(guó)Sigma公司試劑盒)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞和體液免疫指標(biāo)比較:高危HPV組、低危HPV組CD4+細(xì)胞、IgG和IgA明顯低于HPV陰性組和正常組(P<0.05),且高危HPV組CD4+細(xì)胞、IgG和IgA明顯低于低危HPV組(P<0.05);高危HPV組、低危HPV組、HPV陰性組和正常組CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、IgM比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞和體液免疫指標(biāo)比較

2.2各組細(xì)胞因子比較:高危HPV組、低危HPV組IL-2明顯低于HPV陰性組和正常組(P<0.05),且高危HPV組IL-2明顯低于低危HPV組(P<0.05);高危HPV組、低危HPV組IL-4、IL-17和TGF-β明顯高于HPV陰性組和正常組(P<0.05),且高危HPV組IL-4、IL-17和TGF-β明顯高于低危HPV組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞因子比較

2.3各組p16、Ki67蛋白陽(yáng)性率比較:高危HPV組、低危HPV組p16、Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于HPV陰性組和正常組(P<0.05);HPV陰性組p16、Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常組(P<0.05);高危HPV組和低危HPV組p16、Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組p16 Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較n(%)

2.4各組Prdx4、STAT3mRNA表達(dá)比較:高危HPV組、低危HPV組Prdx4和STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于HPV陰性組和正常組(P<0.05),且高危HPV組Prdx4和STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于低危HPV組(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組Prdx4和STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

HPV是宮頸病變的主要病因[4]。HPV可在85%～95%的宮頸癌患者癌組織中檢出[5]。其機(jī)制為HPV通過(guò)黏膜感染靶細(xì)胞,紊亂正常細(xì)胞周期,促使病變組織形成[6]。

T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)能使腫瘤細(xì)胞增值、控制腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。其中CD4+T淋巴細(xì)胞能識(shí)別抗原、激活免疫細(xì)胞及生成抗體抵抗腫瘤生長(zhǎng),并與CD8+T細(xì)胞協(xié)同參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[7]。T細(xì)胞代表機(jī)體免疫總水平,且外周血和宮頸局部免疫情況一致。本研究結(jié)果表示,宮頸病變患者感染HPV后,CD8+無(wú)顯著變化,但CD4+明顯降低,與既往研究[8]報(bào)道相似,說(shuō)明患者T細(xì)胞的輔助及誘導(dǎo)功能下降,增強(qiáng)抑制和殺傷作用并使細(xì)胞免疫功能造成損傷,導(dǎo)致患者感染程度加深。且CD4+隨著HPV持續(xù)感染進(jìn)一步降低,加重細(xì)胞免疫功能損傷。可能機(jī)制為:①HPV的早期蛋白過(guò)度參與機(jī)體局部免疫調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而導(dǎo)致免疫識(shí)別和清除功能降低;②感染過(guò)程中CD4+T細(xì)胞減少,抑制了機(jī)體抗腫瘤免疫作用,使宮頸組織局部免疫微環(huán)境失調(diào)[9,10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HPV陽(yáng)性宮頸病變患者血液IgG、IgA濃度比HPV陰性和對(duì)照組明顯降低,高危感染者兩項(xiàng)指標(biāo)降低更明顯,說(shuō)明患者感染HPV后體液免疫功能受損,無(wú)法產(chǎn)生足量中和抗體將病毒清除,最終造成感染及宮頸病變發(fā)生。

IL-2由Th1分泌,主要參與細(xì)胞免疫;IL-4、IL-17由Th2分泌,主要參與體液免疫,IFN-β激活協(xié)調(diào)機(jī)體免疫系統(tǒng),調(diào)控Th1/Th2平衡[11]。三者密切配合調(diào)控機(jī)體免疫功能。本實(shí)驗(yàn)中高危HPV組、低危HPV組IL-2明顯低于HPV陰性組和正常組(P<0.05),說(shuō)明患者機(jī)體Th1型細(xì)胞功能受到抑制,高危HPV組、低危HPV組IL-4、IL-17和TGF-β明顯高于HPV陰性組和正常組(P<0.05),機(jī)體Th2型細(xì)胞過(guò)度興奮,Th1/Th2失衡,免疫功能紊亂。本研究指出,持續(xù)感染增加紊亂程度。說(shuō)明上述細(xì)胞功能增強(qiáng)與宮頸病變密切相關(guān),且高危型HPV感染可此病變加劇、促進(jìn)宮頸組織惡變產(chǎn)生。

p16可調(diào)控細(xì)胞周期,常見(jiàn)于惡性病變的分子事件。正常上皮細(xì)胞內(nèi)p16表達(dá)水平極低,但病變組織中p16顯著表達(dá)。本研究中高危HPV組、低危HPV組p16、Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于HPV陰性組和正常組(P<0.05);HPV陰性組p16、Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常組(P<0.05);佐證了上述觀點(diǎn)故推測(cè)在p16高表達(dá)可促使宮頸病變。Ki67調(diào)控細(xì)胞周期蛋白,但其作用機(jī)制尚未明確,但已證實(shí)Ki67是病變細(xì)胞主要的增殖標(biāo)志物。Ki67只在病變上皮細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)。本研究中宮頸病變患者p16、Ki67蛋白呈高表達(dá),且與患者HPV感染明顯相關(guān)。說(shuō)明Ki67參與了宮頸病變的發(fā)生與發(fā)展,且患者感染HPV風(fēng)險(xiǎn)隨著p16、Ki67蛋白表達(dá)升高而增加,故可將p16、Ki67蛋白的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果作為宮頸病變的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。

免疫環(huán)境改變能使宮頸細(xì)胞增殖活性受到影響,衡量細(xì)胞惡變風(fēng)險(xiǎn)的重要方法是檢測(cè)相關(guān)基因具體表達(dá)量。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Prdx4增加可導(dǎo)致細(xì)胞免于凋亡并促使腫瘤發(fā)生。STAT3mRNA可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等基因表達(dá)并參與惡性腫瘤的進(jìn)展,其高表達(dá)能使細(xì)胞增殖并阻礙細(xì)胞凋亡。本次研究結(jié)果表示:與低危型HPV感染組及正常對(duì)照組比較,高危HPV組、低危HPV組Prdx4和STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于HPV陰性組和正常組(P<0.05),且高危HPV組Prdx4和STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于低危HPV組(P<0.05)。證實(shí)HPV感染顯著增加宮頸細(xì)胞增殖活力,且隨著病變程度與惡性程度呈逐漸增強(qiáng),甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

綜上所述:HPV感染加重宮頸病變患者免疫調(diào)節(jié)失衡,促進(jìn)宮頸細(xì)胞異常增殖,尤其在高危型HPV感染中,上述作用更加明顯。本實(shí)驗(yàn)存在不足:本研究?jī)H探討了HPV感染組免疫功能變化,未進(jìn)一步將HPV感染類型的免疫功能變化進(jìn)行分析,且相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步臨床研究。