基于GEO數據庫篩選促性腺激素細胞腫瘤發生發展的關鍵差異通路

趙斯達 李儲忠 張亞卓

首都醫科大學北京市神經外科研究所，北京 100070

垂體神經內分泌腫瘤是最常見的顱內腫瘤之一，其發病率為（70～90）/100 000 人［1］。雖然過去“垂體腺瘤”的命名表明該類腫瘤具有良性腫瘤的行為，但長期以來人們已意識到，某些腫瘤亞型在群體中發病率較高［2］。促性腺激素細胞腫瘤是垂體神經內分泌腫瘤術中病理診斷中最常見的類型。促性腺激素細胞腫瘤來源于促性腺激素細胞，占垂體神經內分泌腫瘤的10%～20%［3］。促性腺激素細胞腫瘤占大腫瘤（＞1 cm）的50%，在男性中更為常見［4］。其臨床表現包括勃起功能障礙、頭痛、頭暈、視交叉受壓導致的視野缺陷，以及正常垂體受壓導致的激素缺乏。手術切除是一種有效的治療手段，但手術往往無法治愈那些侵襲性或復發性腫瘤。因此，我們需要尋找腫瘤的生物標志物，開發靶向治療。

本研究通過對GEO 數據庫編號GSE26966 數據中正常樣本和促性腺激素細胞腫瘤樣本的生物信息學分析，為進一步發現促性腺激素細胞腫瘤發生發展的潛在分子機制奠定理論基礎，為腫瘤的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據的獲取從GEO 數據庫中選擇編號為GSE26966 的人促性腺激素細胞腫瘤基因芯片表達數據，該芯片基于GPL570 平臺Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 檢測。該數據由9例正常垂體，10例促性腺激素細胞腫瘤和4例零細胞腺瘤（null cell），本文選取其中9 例正常垂體和10例促性腺激素細胞腫瘤組織的基因芯片表達數據用于本研究。

1.2 差異基因的篩選使用GEO 數據庫中的分析工具GEO2R對該數據進行差異分析，選取其中的促性腺激素細胞腫瘤（n=10）和正常垂體（n=9）組織標本作為分析對象。篩選基因表達差異倍數＞4，P值＜0.01，FDR＜0.05的基因作為本研究的研究對象。

1.3 差異基因的通路富集分析將篩選出的差異基因進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，尋找在促性腺激素細胞腫瘤中存在顯著異常改變的重要通路。該研究中使用R 4.2.1進行生物信息學分析。

1.4 基因之間相互作用網絡利用STRING（https：//cn.string-db.org）網站分析差異表達基因之間的相互作用關系，構建互作網絡。將基因按照相互作用關系多少進行排列，取互作關系最多的前10 個分子進行分析，篩選出與促性腺激素細胞腫瘤相關的關鍵差異基因。

2 結果

2.1 芯片數據中促性腺激素細胞腫瘤與正常垂體組織間差異基因的篩選GSE26966 芯片數據包含38 932 個基因（圖1A）。通過對該數據進行分析，鑒定到1 193 個基因在促性腺激素細胞腫瘤（n=10）和正常垂體組織（n=9）之間差異表達（篩選基因表達差異倍數＞4，P 值＜0.01，FDR＜0.05）。其中在促性腺激素細胞腫瘤中表達下調的基因有830個，表達上調的基因有363個（圖1B、C）。促性腺激素細胞腫瘤和正常垂體組織間的主成分分析結果顯示2 組樣本的表達譜能夠顯著將兩者區分，而組內的各個樣本能夠顯著聚集，具有高度相似性（圖1D）。

圖1 芯片表達譜 A：2 組樣本通過基因芯片檢測共鑒定出38 932 個基因；B：促性腺激素細胞腫瘤和正常垂體組織間差異表達基因火山圖；C：促性腺激素細胞腫瘤和正常垂體組織間差異表達基因熱圖；D：促性腺激素細胞腫瘤和正常垂體組織間主成分分析Figure 1 Microarray expression profiling.A：38 932 genes were identified by microarray result between gonadotroph PitNETs and normal pituitary tissues；B：The volcano diagram between gonadotroph PitNETs and normal pituitary tissues；C：The heatmap diagram between gonadotroph PitNETs and normal pituitary tissues；D：Principal component analysis

2.2 差異基因通路富集分析對差異表達基因進行通路富集分析。GO功能注釋分析結果顯示，差異表達基因主要富集在脂肪細胞分化，脂肪細胞分化的調節和對皮質類固醇的應答3個生物學過程，細胞成分分類顯示差異基因主要富集在含膠原蛋白的細胞外間質，細胞頂端和頂端質膜，分子功能富集結果顯示差異基因主要富集在細胞外間質結構成分，跨膜受體蛋白激酶活性和跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（圖2A）。KEGG通路富集結果顯示差異基因主要富集在PI3K-Akt信號通路，蛋白質消化吸收和ECM-受體相互作用等（圖2B）。PI3K-Akt通路是差異基因富集的主要通路，該信號通路中有46個基因富集，其中有42個基因在PI3K-Akt通路中低表達。

圖2 差異基因富集通路 A：GO功能注釋；B：KEGG通路分析Figure 2 Pathway enrichment analysis.A：GO enrichment analysis results；B：KEGG pathway enrichment analysis results

本文將課題組前期研究中檢測到促性腺激素細胞腫瘤與正常垂體之間差異表達轉錄組數據與GSE26966 芯片數據對比分析，發現2 組數據中共表達的基因有283個，其中共同高表達的基因為56個，共同低表達的基因224 個。將以上共表達的基因進行通路富集分析，結果顯示這些共表達基因主要富集在PI3K-Akt 信號通路（圖3）。

圖3 GSE26966數據與課題組前期轉錄組數據對比分析 A：GSE26966數據與課題組前期轉錄組數據對比分析發現，2組數據中有283個共表達基因；B：283個共表達基因的通路富集分析顯示這些通路顯著富集在PI3K-Akt信號通路中Figure 3Compared analysis between GSE26966 data and our previous microarray analysis.A：There were 283 co-expressed genes between the two group；B：283 genes were mainly enriched in PI3K-Akt signaling pathway

2.3 蛋白之間相互作用網絡將促性腺激素細胞腫瘤和正常垂體組織間的1193 個差異基因在STRING數據庫中進行分析，共識別到1 087 個節點（nodes），形成6 397 個相互作用（number of edges：6 397），平均節點等級為11.87 （average node degree：11.87）。此網絡中節點最多的前10 個基因分別為：IL6、EGFR、JUN、STAT3、FOS、CD44、ESR1、BDNF、SOX2、CCL2，它們所形成的相互作用數目分別為145、140、117、111、99、97、93、89、81 和76（圖4A），其中IL6、EGFR 和BDNF 富集在PI3K-Akt 信號通路中，且它們在促性腺激素細胞腫瘤中的表達水平均低于正常垂體組織（圖4B）。PI3K-Akt 信號通路中富集分子所形成的互作網絡如圖5A，其中24 個基因與IL6 有相互作用關系。共表達熱圖分析表明，IL6 高表達時，與其相互作用的24 個基因也呈現高表達趨勢（圖5B）。

圖4 差異基因的網絡分析 A：1 193 個基因互作網絡分析，篩選互作個數最多的前10個基因；B：前10基因中富集在PI3K-Akt信號通路中的3個基因的表達情況Figure 4 The PPI network of the differently expressed genes.A：The top 10 genes with the most PPI network among 1193 genes.B：The expression of 3 of the top 10 genes enriched in PI3K-Akt signaling pathway

圖5 A：PI3K-Akt 信號通路的互作網絡分析；B：IL6 和與其有相互作用的基因之間的共表達熱圖Figure 5 A：PPI network of the PI3K-Akt signaling pathway；B：Co-expression of IL6 and its interacted genes

3 討論

促性腺激素細胞腫瘤是垂體神經內分泌腫瘤的第二大亞型，僅排在催乳素型腫瘤之后［5］。雖然促性腺激素細胞腫瘤在垂體神經內分泌腫瘤中的發生率較高，但對該腫瘤的研究目前依然較少。另外，與其他腫瘤相比，目前沒有針對該腫瘤的有效治療方式［6］。該腫瘤的首選治療方式為手術治療，但術后仍有部分患者的腫瘤病灶存在殘留，還有部分患者病灶無肉眼可見殘留，但腫瘤仍可復發［7］。因此，尋找有效的治療手段十分必要。

本研究通過對GEO數據庫中的芯片數據進行分析，鑒定到促性腺激素細胞腫瘤與正常垂體組織間有1 193個差異基因（篩選基因表達差異倍數＞4，P 值＜0.01，FDR＜0.05）。KEGG 通路富集分析結果顯示這些差異基因主要富集在PI3K-Akt 信號通路。該通路中有46 個差異基因富集，其中有42 個基因低表達。當把本課題組前期所測芯片數據與GSE26966 芯片數據分析比較時，我們發現2 組數據有283 個共表達的基因，且這些共表達基因主要富集的通路為PI3K-Akt信號通路，可見PI3K-Akt 信號通路在促性腺激素細胞腫瘤中具有重要作用。此外，GO功能注釋分析顯示1 193 個差異基因富集的分子功能相關通路有跨膜受體蛋白激酶活性和跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性。這兩個通路負責蛋白質的磷酸化。在差異表達基因所形成的網絡中，IL6是形成互作關系最多的基因，有145 個相互作用，同時富集在PI3K-Akt信號通路中。可見IL6在該通路中具有重要作用。

PI3K-Akt信號通路由多種細胞刺激或毒性損傷激活，能夠調節細胞基本功能，如轉錄，翻譯，增殖，生長和存活［8］。PI3K-Akt 信號通路的激活與多種疾病相關，如腫瘤、糖尿病和自身免疫病［9］。有研究表明PI3K/AKT 信號的過度激活促進了腫瘤的發生［10］。以往有研究報道PI3K-Akt信號通路參與垂體無功能腫瘤的增殖和侵襲［11］。HICKMAN等［12］報道PI3K-Akt信號通路在促性腺激素細胞腫瘤中異常富集。但是這些研究中未詳細報道PI3K-Akt信號通路在腫瘤相對于正常組織中的分子變化。本研究發現相較于正常垂體組織，促性腺激素細胞腫瘤中PI3K-Akt 信號通路異常富集，且富集在該通路中的基因多數低表達。有研究證實PI3K-Akt信號通路在腫瘤細胞中呈激活狀態［13］。PI3K-Akt信號通路是激酶級聯反應組成的通路，其通過特定的激酶，磷酸酶和蛋白質來調節蛋白質磷酸化和去磷酸化之間的轉變［14］。PI3K由具有蛋白酪氨酸激酶活性的受體或G蛋白偶聯受體激活［15］。GO功能注釋分析顯示1 193個差異基因富集的分子功能相關通路有跨膜受體蛋白激酶活性和跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性。由于該通路的激活主要是通過磷酸化，因此我們猜想該通路中基因對應蛋白通過酪氨酸激酶被磷酸化，通過磷酸化發揮對腫瘤增殖的調節作用，從而導致在細胞中剩余基因的表達水平下降。

本研究利用GEO數據庫篩選出促性腺激素細胞腫瘤與正常垂體組織間的差異基因，通過通路富集分析得出在促性腺激素細胞腫瘤中異常的信號通路，分析該通路在腫瘤發生發展中可能的分子作用機制。PI3K-Akt信號通路在促性腺激素細胞腫瘤中的異常富集為后續腫瘤生物學過程的研究奠定基礎，為尋找新的分子標志物提供可能。