兇險性前置胎盤組織中VEGF、sFlt-1表達及其與胎盤植入的關(guān)系

王珊珊,李 燕,尤志格

(洛陽安和醫(yī)院婦科門診手術(shù)室,河南 洛陽 471000)

兇險性胎盤前置是指上次為剖宮產(chǎn),而此次妊娠為前置胎盤,且胎盤附著于子宮瘢痕處。而胎盤前置及剖宮產(chǎn)史是造成胎盤植入的高危因素,有臨床數(shù)據(jù)表示[1,2],兇險性胎盤前置患者發(fā)生胎盤植入的風險高達50%。目前,胎盤植入被認為與蛻膜發(fā)育不良、滋養(yǎng)細胞過度侵襲相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)在血管形成過程中發(fā)揮重要作用,胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞所產(chǎn)生的VEGF可促進胎盤絨毛血管生成,而VEGF及sFlt-1表達失常可能導致胎盤滋養(yǎng)細胞侵襲能力改變,引起胎盤植入或胎盤淺著床[3,4]。研究兇險性胎盤前置-胎盤植入患者胎盤組織內(nèi)VEGF及sFlt-1表達情況,可能在探索胎盤植入機制中具有積極作用。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將本院2019年1月至2020年6月收治的76例兇險性前置胎盤患者納為觀察組,根據(jù)是否伴有胎盤植入,分為觀察組-1(胎盤植入,n=22)與觀察組-2(非胎盤植入,n=54),同時將因其他因素行剖宮產(chǎn)的30例產(chǎn)婦納為對照組。(1)兇險性前置胎盤診斷標準[5]:前次有剖宮產(chǎn)史,此次妊娠為前置胎盤。前置胎盤定義為妊娠28周以后,胎盤附著于子宮下段,覆蓋宮頸管內(nèi)口,位置較胎兒先露低。(2)胎盤植入診斷標準[5]:術(shù)前超聲檢查提示胎盤后間隙消失,胎盤血竇豐富,術(shù)中,胎兒娩出后,胎盤不能自行剝離,徒手剝離過程中可見胎盤與子宮壁部分或全部相連,術(shù)后病理檢查證實為胎盤絨毛侵入子宮肌層。(3)納入標準:兇險性前置胎盤患者及胎盤植入者分別滿足以上診斷標準,因病情需要行剖宮產(chǎn)終止妊娠;對照組為因社會因素、胎位不正等其他原因行剖宮產(chǎn)者;所有被研究對象均為單胎妊娠;剖宮產(chǎn)前均未臨產(chǎn),無胎膜早破。(4)排除標準:排除合并妊娠期高血壓者、妊娠期糖尿病等其他妊娠合并癥者,合并凝血功能障礙、多器官衰竭、惡性腫瘤、急慢性感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,參與者知情且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清VEGF及sFlt-1水平檢測

剖宮產(chǎn)手術(shù)前12h內(nèi),抽取被研究對象外周靜脈血6mL置于促凝管內(nèi),待血液完全凝固后,4℃條件下,2000rpm/min離心10min,取上層血清,置于-80℃冰箱內(nèi)保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清VEGF及sFlt-1濃度。人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒及人可溶性Fms樣絡(luò)氨酸激酶受體1(sFlt-1)ELISA試劑盒均購自上海博谷生物技術(shù)公司,嚴格按照試劑盒相關(guān)步驟進行檢驗操作,最終得出檢驗樣本中VEGF及sFlt-1濃度。

1.2.2 胎盤組織內(nèi)VEGF及sFlt-1 mRNA表達

1.2.2.1取材

于胎盤娩出后,取胎盤全層。A.兇險性前置胎盤非胎盤植入組及對照組取材部位為:臍帶根部附著處的對應(yīng)區(qū)域。B.兇險性前置胎盤胎盤植入組取材部位為植入病灶中心。組織大小約為1.5cm×1.5cm×1.0cm。取材過程中注意避開出血及鈣化區(qū)域,無菌0.9%NaCl反復(fù)沖洗,無菌紗布吸干水分,置于10%福爾馬林中保存待用。

1.2.2.2 Real-time ROC檢測

(1)提取總RNA:①取100g胎盤組織,置于1.5mLEP管內(nèi),加入Tanzol UP后不斷研磨。②將勻漿液移至離心管內(nèi),室溫下靜置5min,12000rpm 離心5min,取其上清移至新的離心管內(nèi)。③向上述離心液中加入氯仿,蓋緊離心管蓋,距離搖晃使其充分乳化,靜置5min后,同樣轉(zhuǎn)速離心15min。④取勻漿無色上清液至新的離心管內(nèi)。⑤加入與上清液同等體積的異丙醇,將其混勻,靜置10min,同樣轉(zhuǎn)速離心10min。⑥去除上清,保留底部沉淀,加入75%乙醇1mL洗滌離心管管壁,同樣轉(zhuǎn)速離心5min,去除乙醇。⑦室溫干燥沉淀2～5min,加入100μLRNase-free dH2O,反復(fù)吹打,充分溶解RNA。

(2)逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR:①RNA濃度測量:取提取好的RNA2μL于PE管,加入98μL RNaes-free dH2O,同樣100μL RNaes-free dH2O作為空白對照,檢測提取RNA濃度。②引物設(shè)計:引物設(shè)計采用Primer 3軟件,引物序列,SFlt-1上游引物:GTCATCACTCCTAAGCTGCCTTACA,下游引物:TGTTGGAAATCCTGGAACAGAAATC。VEGF上游引物:5’-CAGACGGACAGAAAGACAGAT-3’下游引物:5’-CAGGTGAGAGTAAGCGAAGG-3’③準備PCR管,依次加入反應(yīng)物,首先94℃預(yù)變性5min,72℃延伸7min,反應(yīng)完成后取5μL PCR擴增產(chǎn)物0.9%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定。④按下Real-time RCR,每個反應(yīng)重復(fù)3次,設(shè)計實驗組與陰性對照組,配置反應(yīng)液時先配置總反應(yīng)液再分裝。⑤熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理:待反應(yīng)結(jié)束后,通過AB17500熒光定量PCR儀進行數(shù)據(jù)處理。

1.3 觀察指標

(1)根據(jù)胎盤侵入子宮肌層深度,將兇險性前置胎盤胎盤植入組患者分為A、B、C 3組,其中A組為黏連性胎盤,B組為植入性胎盤,C組為穿透性胎盤。(2)比較觀察組-1、觀察組-2及對照組血清VEGF、sFlt-1水平及胎盤中VEGF、sFlt-1表達水平。(3)觀察不同胎盤植入深度患者血清VEFG、sFlt-1水平及胎盤中VEGF、sFlt-1表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

觀察組-1及觀察組-2妊娠次數(shù)、分娩次數(shù)、術(shù)中出血量均顯著高于對照組(P<0.05),觀察組-1術(shù)中出血量、手術(shù)時間及術(shù)后住院時間均顯著高于觀察組-2與對照組(P<0.05)。

表1 3組一般資料比較

2.2 血清VEGF及sFlt-1水平比較

3組血清VEGF水平無顯著性差異(P>0.05),3組血清sFlt-1水平差異顯著(P<0.05),其中觀察組-1血清sFlt-1水平顯著高于觀察組-2與對照組(P<0.05),觀察組-2血清sFlt-1水平顯著高于對照組(P<0.05),見表2。

表2 3組血清VEGF及sFlt-1水平比較

2.3 不同植入深度患者血清VEGF及sFlt-1水平比較

胎盤植入不同深度患者血清VEGF無顯著性差異(P>0.05),血清sFlt-1水平差異顯著(P<0.05),C組患者血sFlt-1水平顯著高于A、B兩組(P<0.05),B組血清sFlt-1水平與A組無顯著性差異(P>0.05),見表3。

表3 不同植入深度患者血清VEGF及sFlt-1水平比較

2.4 胎盤組織中VEGF及sFlt-1表達量比較

3組胎盤組織中VEGF mRNA表達無顯著性差異(P>0.05),3組sFlt-1 mRNA表達量及VEGF/sFlt-1差異顯著(P<0.05),其中觀察組-1胎盤組織中sFlt-1 mRNA表達量顯著高于觀察組-2與對照組(P<0.05),VEGF/sFlt-1顯著低于觀察組-2與對照組(P<0.05),觀察組-2胎盤組織中sFlt-1 mRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05),VEGF/sFlt-1顯著低于對照組(P<0.05),見表4。

表4 3組胎盤組織中VEGF及sFlt-1 mRNA表達量比較

2.5 不同植入深度患者胎盤組織VEGF及sFlt-1表達量比較

不同植入深度患者胎盤組織VEGFmRNA表達量無顯著性差異(P>0.05),但sFlt-1 mRNA表達量及VEGF/sFlt-1差異顯著(P<0.05),其中C組sFlt-1 mRNA表達量顯著高于A、B兩組(P<0.05),VEGF/sFlt-1顯著低于A、B兩組(P<0.05),B組sFlt-1 mRNA表達量顯著高于A組(P<0.05),VEGF/sFlt-1顯著低于A組(P<0.05),見表5。

表5 不同植入深度患者胎盤組織VEGF及sFlt-1mRNA表達量比較

3 討論

剖宮產(chǎn)手術(shù)、子宮手術(shù)史是引起胎盤植入的重要因素,剖宮產(chǎn)及其他子宮手術(shù)史將引起子宮內(nèi)膜受損,進而增加胎盤植入的風險。胎盤植入的形成與子宮下段蛻膜發(fā)育不良、脫膜層缺失,導致胎盤絨毛穿透底蛻膜有關(guān)[6～8]。而前置胎盤的主要病因也是子宮下段蛻膜層缺失,胎盤植入與胎盤前置有著相似的病理原因[9～11]。本文將醫(yī)院近年來收治的76例兇險性胎盤前置患者納為研究對象,其中有22例患者合并胎盤植入,將同期因社會因素等其他原因行剖宮產(chǎn)的30例產(chǎn)婦納為對照組。分析發(fā)現(xiàn),與對照組產(chǎn)婦相比,兇險性前置胎盤患者妊娠次數(shù)、分娩次數(shù)更多,術(shù)中出血量更大、手術(shù)時間、術(shù)后住院時間更長。而對于合并胎盤植入的患者來說,其術(shù)中出血量、手術(shù)時間及術(shù)后住院時間均最高/長。提示兇險性前置胎盤合并胎盤植入將加重產(chǎn)婦生產(chǎn)負擔,威脅其生命安全。

胎盤是血供最為豐富的器官之一,胎盤血管生長及分化調(diào)控直接關(guān)系到孕期胎盤的發(fā)育,VEGF可直接刺激血管內(nèi)皮細胞移動、增殖及分化,增加微血管通透性,促進體內(nèi)新生血管形成[12]。sFlt-1可與VEGF相結(jié)合,抑制其生物活性,正常妊娠過程中,VEGF與sFlt-1維持平衡,以確保胎盤的正常生長,而異常血管的形成可導致蛻膜發(fā)育不良,滋養(yǎng)層過度侵襲,進而形成胎盤植入[13]。

本研究發(fā)現(xiàn),觀察組-1(兇險性胎膜前置合并胎盤植入)、觀察組-2(兇險性胎盤前置無胎盤植入)患者及對照組間,血清VEGF水平無明顯差異,但血清sFlt-1水平差異明顯,與對照組比較,觀察組血清sFlt-1水平明顯升高,且伴胎盤植入的觀察組-1血清sFlt-1水平更高。此外,根據(jù)胎盤植入深度,將觀察組-1分為A(黏連性胎盤)、B(植入性胎盤)、C(穿透性胎盤)3組,比較發(fā)現(xiàn),不同植入深度患者血清VEGF水平無明顯差異,但隨著植入深度的加深,患者血清sFlt-1水平呈上升趨勢。以上發(fā)現(xiàn)說明,血清sFlt-1濃度升高在提示前置胎盤及胎盤植入中具有良好價值。

采集胎盤組織進行Real-time ROC檢測被研究者胎盤組織VEGF mRNA及sFlt-1 mRNA水平發(fā)現(xiàn),觀察組與對照組胎盤組織VEGF及sFlt-1 mRNA表達水平與其血清濃度一致,觀察組及對照組VEGF mRNA表達量無顯著性差異,但觀察組胎盤組織sFlt-1 mRNA表達量顯著高于對照組,且隨著胎盤植入深度的加深,胎盤組織sFlt-1 mRNA表達量逐漸上升,VEGF/sFlt-1失衡越嚴重。有學者發(fā)現(xiàn)[14],胎盤植入母體血清VEGF濃度降低,sFlt-1濃度上升,本研究中,胎盤植入母體中血清VEGF濃度及胎盤組織中VEGF mRNA表達量與對照組無明顯差異,可能與本文研究樣本量過小有關(guān),但sFlt-1改變趨勢與上述研究結(jié)果一致。

以上研究結(jié)果提示,胎盤前置及胎盤植入均與血管內(nèi)皮生長因子表達異常密切相關(guān)。既往研究表明[15],胎盤植入將造成底蛻膜內(nèi)多核巨噬細胞數(shù)量減少,多核巨噬細胞減少后,其所分泌的VEGF也對應(yīng)減少,而sFlt-1表達上升可被視為對血管生成減少的直接性反饋,也可能是為滿足胎兒生長代謝的代償機制。

綜上所述,兇險性前置胎盤患者胎盤植入風險更高,而胎盤前置與胎盤植入與血管內(nèi)皮生長因子作用異常密切相關(guān),兇險性胎盤前置合并胎盤植入患者胎盤組織中sFlt-1表達量上升,母體血清sFlt-1濃度也異常升高,VEGF/sFlt-1失衡可有效提示胎盤植入。