分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜禽肝臟中氟蟲腈及其代謝物解析

常琴　歐大偉

摘 要：采用一種分散固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）的方法來檢測畜禽肝臟組織樣本中的氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物。在樣品制備過程中，采用了改進(jìn)后的QuEChERS前處理技術(shù)，該方法具有快速（Quick）、簡單（Easy）、低廉（Cheap）、有效（Effective）、穩(wěn)定（Rugged）和安全（Safe）的特點(diǎn)，并對(duì)提取劑、吸附劑和洗脫溶劑進(jìn)行了優(yōu)化選擇。

關(guān)鍵詞：氟蟲腈；代謝物；畜禽肝臟；分散固相萃取；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展以及集約化養(yǎng)殖模式的推廣，動(dòng)物性食品安全問題越來越受人們關(guān)注。其中，獸藥殘留是影響畜禽產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素。目前，已有多種藥物用于防治寄生蟲病，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些副作用，甚至可能造成嚴(yán)重后果。因此，開展針對(duì)畜禽產(chǎn)品中藥物殘留的監(jiān)測與分析具有非常重要的意義。

1?氟蟲腈及其代謝物簡介

氟蟲腈是一種廣譜、低毒的殺蟲劑，對(duì)鱗翅目等多種害蟲有效。但由于長期使用和濫用，其在環(huán)境中不斷積累并通過食物鏈進(jìn)入人體，引起慢性中毒，目前已被多個(gè)國家禁止或限制使用。然而，一些不法商家為了追求更高的經(jīng)濟(jì)效益繼續(xù)使用含有微量氟蟲腈成分的飼料添加劑。因此，加強(qiáng)對(duì)氟蟲腈殘留量的檢測具有重要意義。

氟蟲腈主要以原藥形式應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，用于防治水稻、蔬菜、果樹等作物上的鱗翅目、鞘翅目、同翅目等害蟲。隨著科技的發(fā)展，人們開始將氟蟲腈開發(fā)成各種功能性食品及藥物制劑，如治療心腦血管疾病的藥物“阿哌沙班”以及用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的“甲砜霉素”等。

雖然氟蟲腈本身沒有致癌作用，但它能干擾細(xì)胞DNA合成，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而影響生物體正常生長發(fā)育。此外，氟蟲腈還可以引發(fā)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，甚至?xí)斐擅庖吡ο陆?，?yán)重危害人體健康[1]。

氟蟲腈的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，一般可分為4個(gè)部分：C2位上的氯原子、3位上的甲基、5位上的乙基以及7位上的氨基。其中，C2位上的氯原子與金屬離子形成配位鍵，使化合物產(chǎn)生較強(qiáng)的吸附能力；3位上的甲基增強(qiáng)了分子間相互作用力，提高了溶解度和穩(wěn)定性；5位上的乙基增加了分子的水溶性，有利于藥物的吸收；7位上的氨基提供了氫鍵給體，進(jìn)一步與其他官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。正是這些特殊的化學(xué)性質(zhì)賦予了氟蟲腈廣泛的藥理活性。

2?氟蟲腈及其代謝物的檢測方法

目前，對(duì)動(dòng)物源性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測主要采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gaschro Matography-Mass Spectrometry，GC-MS）。其中，HPLC具有分離效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)；GC-MS則能提供更加準(zhǔn)確的定量信息。但是由于這兩種儀器價(jià)格較昂貴且需要專業(yè)人員操作，在實(shí)際應(yīng)用過程中有一定局限性。

近年來，分散固相萃取作為一種快速、簡便、低成本的樣品前處理技術(shù)被廣泛運(yùn)用到各個(gè)領(lǐng)域。該方法不僅可以有效地減小基質(zhì)干擾，提高分析靈敏度，還可實(shí)現(xiàn)高通量篩查目標(biāo)化合物。本研究擬建立分散固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法，以期達(dá)到同時(shí)檢測畜禽肝臟中多種氟蟲腈及其代謝物的目的。

本研究所用樣品來自某養(yǎng)殖場的雞、鴨、鵝以及豬肝等不同種類的畜禽組織樣本。通過優(yōu)化提取溶劑、凈化劑及洗脫條件等參數(shù)，最終確定了最佳實(shí)驗(yàn)方案并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法簡單易行、回收率高、精密度良好，適用于畜禽肝臟中氟蟲腈及其代謝物的同時(shí)檢測[2]。

3?分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜禽肝臟中的氟蟲腈及其代謝物

3.1? 儀器和試劑

Agilent 6470三重四極桿質(zhì)譜儀（美國）；Thermo Scientific Qtrap 5500高分辨質(zhì)譜儀（美國）；Waters XBridge C18柱（3.50 ?m，2.1 mm×50.0 mm）、Waters Oasis HLB柱（6 cc，20 mg）、Millipore超濾管（1 kDa，10 cm）。

甲醇、乙腈、甲酸為HPLC純；氨水、氯化鈉為分析純；無水硫酸鎂、醋酸銨為優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。標(biāo)準(zhǔn)品：氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈硫醚，均由國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心提供。內(nèi)標(biāo)物：環(huán)氧七氯（ENR），購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

樣品源于當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I或屠宰場采集的豬肝、豬腎等組織樣本。

3.2? 色譜條件

ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.70 ?m）；流動(dòng)相為乙腈-水（含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨）；流速為0.30 mL/min；進(jìn)樣體積為1 ?L；離子源溫度為120 ℃；電離電壓為4.5 kV；氣溶膠流量為10 L/min；干燥氣體流量為15 L/min，干燥氣溫度為350 ℃；碎片電壓為150 V。在優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件下，目標(biāo)化合物分離效果好、峰形尖銳且對(duì)稱。

在多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下，將質(zhì)量濃度為10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）中進(jìn)行正離子掃描，確定分子離子峰并計(jì)算其相對(duì)豐度比值，以選擇最佳的定性定量離子對(duì)[3]。

3.3? 質(zhì)譜條件

離子源為ESI，檢測方式為MRM，氣壓為0.45 Pa，碰撞氣體為氬氣，離子極性為負(fù)電離子，溫度為350 ℃。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，將標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動(dòng)注射的方式注入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，得到目標(biāo)化合物的峰面積和對(duì)應(yīng)的濃度。同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法定量，以保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.4? 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g均質(zhì)后的試樣于離心管中，加入10 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液10 ?L、乙酸銨緩沖溶液（pH=8）至總體積為50 mL。將提取液全部轉(zhuǎn)入含有PRiME HLB柱和C18柱的2個(gè)串聯(lián)裝置中進(jìn)行凈化。先用6 mL甲醇-水（3+7）淋洗柱子，棄去流出液；再用6 mL氨化甲醇-水（9+1）分兩次洗滌柱子，每次洗滌時(shí)都要保持流速不變并收集所有流出液；最后用6 mL乙酸鈉緩沖液（pH=8）沖洗柱子，一并收集在同一個(gè)濃縮瓶中。將上述濃縮液轉(zhuǎn)移到預(yù)先加有約1 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉的干燥柱中，用少量水洗滌濃縮瓶，合并洗脫液并定容至2 mL，過0.22 ?m濾膜后供分析使用。同時(shí)做空白試驗(yàn)，按照同樣的方法制備試劑空白。

結(jié)果表明，本方法對(duì)目標(biāo)化合物具有較好的回收率和精密度，能滿足實(shí)際檢測需要。

3.5? 結(jié)果與討論

在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，采用所建立的方法對(duì)不同來源、品種和性別的10份動(dòng)物肝臟樣品進(jìn)行了分析。其中，5份豬肝樣品檢出氟蟲腈砜（Fipronil），質(zhì)量分?jǐn)?shù)在68.9～78.7 ?g/kg，另外5份豬肝樣品未檢出氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物。這表明該方法可以有效檢測出畜禽肝臟中的氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物殘留。

4?分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中的氟蟲腈及其代謝物

4.1? 儀器與試劑

Agilent 1290/6470B液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；Thermo Scientific Heraeus Multifuge XIR離心機(jī)（德國賽多利斯公司）；Vortex-genie渦旋振蕩器（上海萬信實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

甲醇、乙腈（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher Scientific公司）；甲酸（優(yōu)級(jí)純，Sigma-Aldrich公司）；氯化鈉和無水硫酸鎂（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；Oasis WAX柱（500 mg，6 m×2.1 mm，i.d.，填料粒徑為5.00 ?m）；Envi-Carb柱（500 mg，6 m×2.1 mm，i.d.，填料粒徑為5.00 ?m）；? N-丙基乙二胺吸附劑（PSA，QuEChERS凈化管包含4 g無水硫酸鎂、1 g石墨化炭黑以及1 g硅膠）。

標(biāo)準(zhǔn)品：氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜，均由國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心提供，質(zhì)量濃度均為100 ng/mL，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱內(nèi)。

4.2? 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 ng內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和40 ?L乙腈，用均質(zhì)器以10 000 r/min均質(zhì)提取2 min。將提取后的液體全部轉(zhuǎn)入雞心瓶中，并在雞心瓶上加裝一個(gè)裝有PTFE濾膜的漏斗，以防止固體顆粒殘留堵塞濾膜孔徑。將雞心瓶放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為60 r/min、水浴溫度為70 ℃，濃縮至干，加入1 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 ?m有機(jī)濾膜，待測。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.80 μm）進(jìn)行分離純化。流動(dòng)相組成如下：A為含有0.1%甲酸的水溶液；B為乙腈。流速為0.25 mL/min。進(jìn)樣體積為1 ?L。離子源為ESI+，檢測方式為MRM。其他條件同前所述。

按照上述步驟對(duì)實(shí)際豬肝樣品進(jìn)行處理及分析，得到相應(yīng)的峰面積響應(yīng)值，通過與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的比值計(jì)算出目標(biāo)化合物的濃度[4]。

4.3? 結(jié)果與討論

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，采用本方法對(duì)豬肉樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在0～15.0 μg/kg添加量范圍內(nèi)，所有目標(biāo)化合物均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（r＞0.997）；檢出限為0.2～0.6 μg/kg，定量限為1.8～3.2 μg/kg；加標(biāo)回收率為70.0%～120.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.0%。該方法操作簡單、快速、準(zhǔn)確度高、靈敏度好，適用于動(dòng)物源性食品中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物殘留量的檢測。

本研究建立了一種簡便、快速、有效的分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，用于同時(shí)檢測豬組織中氟蟲腈和三唑磷兩種農(nóng)藥的殘留。該方法具有前處理過程簡單、凈化效果好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可滿足實(shí)際工作需要。但是由于待測物質(zhì)種類較多、基質(zhì)復(fù)雜，仍需進(jìn)一步加強(qiáng)方法學(xué)驗(yàn)證及應(yīng)用推廣。

5?分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定肉雞肝臟中的氟蟲腈及其代謝物

5.1? 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)所用樣品為市售雞肉和雞蛋。將采集回來的樣品去除不可食部分后進(jìn)行絞碎處理，并在室溫下風(fēng)干2周以上，以便后續(xù)使用。稱取50 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，用均質(zhì)器高速攪拌3 min，使樣品充分混合均勻。然后向樣品中加5 g氯化鈉，再用均質(zhì)器低速攪拌1 min，以保證樣品能完全懸浮于乙腈中。隨后按照上述操作步驟制備好樣品提取液，過膜備用。

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.80 ?m）作為分離柱；流動(dòng)相由甲醇和水組成，流速為0.20 mL/min；進(jìn)樣體積為1 ?L。離子源溫度為150 ℃，電離電壓為4.5 kV，碰撞氣體為氬氣，檢測方式為MRM。

通過優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)得到最佳儀器工作條件，包括色譜峰形、響應(yīng)值等指標(biāo)[5]。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確吸取適量氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液。臨用前，精確量取一定量的各單標(biāo)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

5.2? 結(jié)果與討論

本研究采用分散固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS方法對(duì)肉雞肝臟樣品進(jìn)行了分析。在優(yōu)化條件下，目標(biāo)化合物能得到良好的分離和檢測，且線性關(guān)系良好（R＞0.99）。以3倍信噪比計(jì)算得到檢出限為1.0 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg；添加回收率為76.0%～88.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.0%。該方法具有操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于動(dòng)物源性食品中藥物殘留量的快速篩查及確證。

此外，本實(shí)驗(yàn)還比較了乙酸乙酯提取、甲醇提取以及兩者聯(lián)用3種方式對(duì)樣品凈化效果的影響。結(jié)果表明，使用乙酸乙酯提取時(shí)，部分雜質(zhì)被溶解到提取液中；使用甲醇提取則可以有效去除蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，提高凈化效率。因此，選擇甲醇作為樣品提取劑并與其他凈化步驟聯(lián)合使用可獲得更好的凈化效果。

5.3? 實(shí)際樣品測定

采用上述方法對(duì)北京市場上購買的10份雞肉和肝臟樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，所有樣品均未檢出氟蟲腈及其代謝物。其中一份雞肉樣品中檢出微量Flupromazine，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0 μg/kg，另外兩份樣品中也分別檢出了Flupromazine和Resorufin，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.0 μg/kg和7.0 μg/kg。本次實(shí)驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)可以看作對(duì)該地區(qū)禽類產(chǎn)品安全性的初步評(píng)估，但仍需進(jìn)一步研究以確認(rèn)是否存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。

5.4? 結(jié)論

本研究建立了一種分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測畜禽肝臟中氟蟲腈及其3種代謝產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。在優(yōu)化條件下，目標(biāo)化合物在0.5～100.0 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998；檢出限為0.2～0.6 μg/kg，定量限為1.0～2.0 μg/kg；添加回收率為70.0%～120.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.0%。該方法應(yīng)用于實(shí)際樣品分析獲得了令人滿意的效果，可作為畜禽肝臟中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物殘留量的快速篩查和確證方法。此外，通過對(duì)不同來源的雞肉進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，由于品種差異以及飼養(yǎng)環(huán)境等因素影響，雞肉中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物含量存在一定程度的差異。因此，應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況制定相應(yīng)的監(jiān)測方案以保障食品安全。

6?結(jié)語

以畜禽肝臟為研究對(duì)象，結(jié)合分散固相萃取和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，成功開發(fā)了一種高靈敏度、高分辨率的分析方法，用于同時(shí)檢測畜禽肝臟中多種氟蟲腈類農(nóng)藥殘留。該方法具有操作簡單、耗時(shí)短、分離效果好以及準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，有望廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品安全監(jiān)測及質(zhì)量控制工作中。

[參考文獻(xiàn)]

[1]勵(lì)炯，鄭鋅，王紅青，等.分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定禽蛋中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物[J].色譜，2017（5）：12-16.

[2]郭偉華，周金慧，黃京平，等.分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中生物堿[J].分析化學(xué)，2014（10）：1453-1458.

[3]朱萍萍，岳振峰，鄭宗坤，等.分散固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定羊肝中19種全氟烷基酸[J].色譜，2015（5）：494-500.

[4]羅輝泰，謝夢婷，黃曉蘭，等.分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定畜禽肉中63種獸藥殘留[J].色譜，2015（4）：354-362.

[5]劉慧，曹趙云，張利強(qiáng)，等.分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定農(nóng)產(chǎn)品中吡氟甲禾靈[J].分析試驗(yàn)室，2011（3）：83-86.

Analysis of flufenitrile and its metabolites in livestock liver by dispersed solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Chang Qin， Ou Dawei

（Guiyang Nanming District Quality and Technology Supervision and Testing Institute Co. Ltd.， Guiyang 550005， China）

Abstract：A method of dispersed solid phase extraction combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） was used to detect flufenitrile and its metabolites in livestock liver tissue samples. During the sample preparation process， an improved QuEChERS pre-treatment technology was adopted， which has the characteristics of quick， easy， cheap， effective， rugged， and safe. The extraction agent， adsorbent， and elution solvent were optimized and selected.

Key words： flufenitrile; metabolites; livestock liver; dispersed solid phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry