水稻小粒突變體tm282的遺傳分析和初步定位

高海京 楊芝笛

摘 要 粳稻品種中花11（ZH11）經(jīng)過(guò)60Co-γ輻射誘變，得到了一個(gè)小粒突變體tm282，對(duì)其進(jìn)行遺傳分析和初步定位以篩選合適的粒型控制基因。農(nóng)藝性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，該突變體株高變矮，穗變短且稀疏，籽粒變小；組織細(xì)胞學(xué)觀察可知，突變體穎殼上表皮細(xì)胞數(shù)目變少，但是細(xì)胞長(zhǎng)度無(wú)明顯變化；遺傳分析表明，tm282小粒突變?yōu)閱坞[形核基因控制，利用多重比較分析方法將目的基因初步定位于第七染色體483 kb區(qū)段內(nèi)，該區(qū)段未有相關(guān)基因報(bào)道，推測(cè)是一個(gè)控制水稻粒型的新基因。

關(guān)鍵詞 水稻；tm282；遺傳分析；基因定位

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.12.077

水稻是全球范圍內(nèi)最主要的糧食作物，為全球超過(guò)50%的人口提供食物來(lái)源，提高作物品種的產(chǎn)量潛力是水稻育種的基本目標(biāo)[1]。構(gòu)成水稻產(chǎn)量的三要素包括粒重、穗粒數(shù)、有效穗數(shù)，其中粒重由籽粒形狀和籽粒灌漿程度決定，即由粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚決定[2]。挖掘粒型調(diào)控的新基因不僅可以豐富粒型遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還可以提高水稻的產(chǎn)量[3]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小粒突變體tm282是從粳稻品種中花11（ZH11）經(jīng)過(guò)60Co-γ輻射誘變得到的突變體中初步鑒定出來(lái)的。水稻在揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)田種植，播種30 d后單苗移栽，每行10株，行距為20 cm，株距為15 cm，常規(guī)大田統(tǒng)一水肥管理，在成熟期收種曬干后低溫保存。

1.2 遺傳分析群體和基因定位群體構(gòu)建

將tm282與ZH11回交，得到F1代，F(xiàn)1自交得到分離群體F2進(jìn)行遺傳分析，同時(shí)將tm282與珍汕97B（ZS97B）雜交得到F2群體進(jìn)行初步定位，在F2群體中篩選極端表型單株與輪回親本ZS97B回交構(gòu)建BC1F2群體進(jìn)行精細(xì)定位。

1.3 農(nóng)藝性狀考察

水稻乳熟期，選取10株長(zhǎng)勢(shì)相同的單株測(cè)量土面至穗頂（不計(jì)芒）的高度，記為株高；每株選取3個(gè)稻穗進(jìn)行穗部農(nóng)藝性狀考察，用直尺測(cè)量穗頸節(jié)到穗頂端長(zhǎng)度，記為穗長(zhǎng)；選取50～100粒成熟飽滿的種子，用掃描儀對(duì)粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比等數(shù)據(jù)進(jìn)行考察。同時(shí)考察了突變體與野生型的穗粒數(shù)、千粒重、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)等性狀。

1.4 穎殼的掃描電鏡（SEM）觀察

在揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心進(jìn)行掃描電鏡觀察。篩選發(fā)育正常的成熟籽粒，用75%酒精洗凈表面，晾干；用雙面膠將水稻籽粒粘在底座上，噴金；在掃描電鏡（蔡司GeminiSEM 300超高分辨率場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡）下觀察，于12×（全籽粒觀察）、500×（細(xì)胞觀察）倍率下觀察、拍攝圖像。

1.5 突變體tm282的初步定位

利用混池分組分析法（Bulked Segregation Analysis，BSA）對(duì)突變體tm282進(jìn)行初步定位，在tm282與ZS97B雜交F2群體中篩選突變體極端表型（極小粒）和正常表型（大粒）各20株，將2份葉片等量混合，構(gòu)成2個(gè)極端混池。利用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取2個(gè)極端混池的DNA后，送武漢博越致和生物科技有限公司進(jìn)行基因組測(cè)序及連鎖分析[4]。

同時(shí)從F2群體中篩選極端表型單株與輪回親本ZS97B進(jìn)行回交構(gòu)建BC1F2群體，從該群體中篩選不同重組類型的導(dǎo)入系，利用SPSS進(jìn)行多重比較分析，對(duì)小粒基因進(jìn)行精細(xì)定位。DNA提取采用CTAB法。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、53～58 ℃（退火溫度根據(jù)引物GC含量進(jìn)行調(diào)整）退火30 s、72 ℃延伸30 s（根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度調(diào)整，1 min擴(kuò)增1 kb）35～38個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min反應(yīng)結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體tm282的農(nóng)藝性狀考察

通過(guò)對(duì)野生型ZH11和突變體tm282觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比突變體株高變矮（圖1A），分蘗減少，穗直立、短且稀疏（圖1A、圖1B），水稻籽粒明顯變小（圖1C）。具體農(nóng)藝性狀考察見(jiàn)表1，總體來(lái)看突變體tm282穗長(zhǎng)變短，粒數(shù)變少，二次枝梗數(shù)變少。

2.2 tm282穎殼細(xì)胞觀察

對(duì)野生型和突變體成熟籽粒的穎殼上表皮進(jìn)行掃描電鏡（SEM）觀察，在相同視野下，突變體比野生型細(xì)胞排列得更加致密（圖2A、圖2B）。對(duì)穎殼上表皮細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)掃描拍照視野內(nèi)，野生型細(xì)胞數(shù)約為5 384個(gè)，突變體細(xì)胞數(shù)約為4 450個(gè)，細(xì)胞總數(shù)目顯著減少了17.35%。野生型和突變體穎殼上表皮細(xì)胞長(zhǎng)度平均值分別為69.5 μm和64 μm，無(wú)明顯變化。綜合分析，tm282籽粒變短，可能是穎殼細(xì)胞數(shù)目減少引起的。

2.3 突變體tm282的遺傳分析

以突變體tm282為母本，與野生型ZH11雜交，F(xiàn)1代植株表型與ZH11相似；在F2代中，植株表型發(fā)生分離，與突變體表型相似的有134個(gè)單株，與野生型表型相似的有499個(gè)單株；卡方測(cè)驗(yàn)表明F2群體中野生型表型與突變體表型性狀分離比為2.45∶1，基本符合3∶1，說(shuō)明該突變體性狀的變化由一對(duì)單隱性核基因控制。

2.4 BSA關(guān)聯(lián)分析

為確定控制tm282小粒突變體隱形性狀的基因在基因組的位置，在F2群體中選取極端小粒及正常表型與ZH11或ZS97B各20株混合構(gòu)建2個(gè)極端池。對(duì)突變體tm282、ZS97B及2個(gè)極端混池進(jìn)行全基因組測(cè)序。連鎖分析將該基因定位于第七染色體，定位區(qū)間在18255211～21519751 bp。

2.5 tm282精細(xì)定位圖

為了進(jìn)一步縮小該基因區(qū)間，利用tm282突變體與ZS97B雜交得到F1植株，經(jīng)過(guò)F2代分離，從F2代群體中篩選出與突變體穗型相似的單株與ZS97B回交，構(gòu)建BC1F2群體進(jìn)行精細(xì)定位。

通過(guò)對(duì)1 500株BC1F2群體進(jìn)行基因型檢測(cè)，篩選出在分子標(biāo)記LInD7-280～LInD7-331發(fā)生交換的單株（包括純合和雜合交換），最后利用雜合單株繼續(xù)自交，進(jìn)一步擴(kuò)大群體，獲得5 000株的BC1F2群體。在標(biāo)記LInD7-302～LInD7-331密集標(biāo)記，篩選純合的重組單株，最終在目標(biāo)區(qū)段篩選得到13種不同重組類型的純合導(dǎo)入系，根據(jù)基因型分別命名為M1～M13。

如圖4所示，導(dǎo)入系M2和ZS97B粒長(zhǎng)較長(zhǎng)，分別為8.01 mm和8.04 mm，與M3、M4、M5、M8及M9沒(méi)有顯著差異；導(dǎo)入系M1、M6、M11的平均粒長(zhǎng)低于7.00 mm，與M7、M10、M12和M13沒(méi)有顯著差異。結(jié)合以上14種不同重組類型的基因型和粒長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)，最終將tm282精細(xì)定位于標(biāo)記LInD7-311～LInD7-315，物理距離約為483 kb。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)將tm282基因定位于水稻第七號(hào)染色體483 kb區(qū)段內(nèi)，該區(qū)段中未見(jiàn)有關(guān)影響控制水稻粒型的基因報(bào)道，推測(cè)tm282是一個(gè)新的影響水稻籽粒大小的基因，對(duì)該基因的研究有助于進(jìn)一步闡明水稻籽粒大小調(diào)控機(jī)理，發(fā)掘粒型新基因。

在所有已經(jīng)克隆的調(diào)控水稻穗型和粒型的基因中，有許多一因多效基因，不僅調(diào)控水稻粒型，還參與水稻其他性狀或者組織器官的發(fā)育，如直立穗基因DEP1在改變穗型的同時(shí)，導(dǎo)致水稻籽粒變小，株高變矮[5]。同時(shí)粒型和穗型是受多基因控制的復(fù)雜性狀，不僅受到基因調(diào)控，還和水稻遺傳背景和種植環(huán)境相關(guān)。如SMG12基因突變導(dǎo)致籽粒變短，株高變矮，一次枝梗、二次枝梗數(shù)都減少[6]。本試驗(yàn)的材料tm282突變體不僅在穗型粒型上有明顯變化，還在株高、分蘗、穗粒數(shù)上有變化。遺傳分析的結(jié)果證明了tm282突變體是一個(gè)隱性單核基因突變體。

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（責(zé)任編輯：張春雨）