青刺尖油枯的化感作用及其化感物質的分析

謝慶玲, 劉 剛,2*, 夏 陳, 古春梅,趙甲元,2, 張義蘭, 汪淑芳,2

(1. 四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101; 2. 四川師范大學 鄉村振興與生態規劃研究所, 四川 成都 610101;3. 四川省農業科學院 農產品加工研究所, 四川 成都 610101)

青刺尖(Prinsepiautilis)屬薔薇科扁核木屬多年生的灌木,種子可以榨取食用油,又名打油果、牛奶捶、阿納斯(納西族)、出裸(彝族)和梅花刺等,為落葉灌木,叢生,株高1～5 m,生長于海拔1 000～3 000 m的山坡、溪邊和荒地,雌雄同株,冬季開花,夏季結果,主要分布于云貴川、臺灣和西藏等地[1-3].《云南天然藥物圖鑒》記載,性味苦、辛、涼,在《貴州中草藥》《中藥大辭典》《云南民族藥志》中也有記載[4].《滇南本草》記載[5]:青刺尖“性微寒,味苦.攻一切瘡毒癰疽”.其莖葉主治癰疽毒瘡、風火牙痛、槍傷、骨折、蛇咬傷;根主治虛咳、久咳、積食、風濕性關節炎;果主治目翳多淚、消化不良等[6-7].近幾年對青刺尖的研究發現,它有很高的經濟價值[8]、藥用價值[9-10]和營養價值[11],種子油有耐缺氧[12]、調節血脂[13]、抗腦缺氧[14]等功能,有很高的開發價值,但是,多數研究集中在保健功能.隨著對青刺尖油脂的大規模利用,油枯等副產物的研究也需要加強.但是,青刺尖油枯的研究較少,如提取物對常見致病菌有不同程度的抑殺作用[15].

在前期研究青刺尖油脂的過程中[16],發現油枯中的揮發性物質對其他植物的生長有影響,但是,該現象尚未見文獻報道,物質基礎也未知.本研究以豌豆(Pisumsativum)和青稞(Hordeumvulgarevar.coelesteLinnaeus)這兩種經濟作物為材料,研究青刺尖油枯揮發物的化感作用,旨在了解其對植物生長的影響作用,為進一步綜合開發與利用青刺尖奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器2020年9月于重慶市酉陽縣采集黃花蒿,經鑒定符合黃花蒿(Artemisiaannua)的特征[17];青刺尖于2019年4月采自四川省阿壩州若爾蓋縣,經鑒定符合青刺尖(Prinsepiautilis)的特征[17],將油枯置于30 ℃烘20 min,粉碎過20目篩,冷藏備用[16].豌豆、青稞種子從種子公司購得.試劑和儀器:GC/MS(PerkinElmer)、烘箱、移液槍、透明干燥室(29 cm×19 cm×39 cm)、粉碎機.

1.2 試驗方法

1.2.1效應植物的處理 分別選取飽滿、均勻,且無病蟲害的豌豆和青稞種子,質量分數0.5%高錳酸鉀滅菌8 min,無菌水清洗3～5次,20 ℃浸泡24 h,青稞種子浸泡后置于4 ℃春化處理,得到吸脹種子.吸脹種子置于有雙層無菌水浸潤濾紙的Φ9 cm培養皿,適應條件萌發,得發芽種子.選取發芽一致的種子,分別播種到Φ10 cm花盆,每盆10粒,得到幼苗.

1.2.2試驗設計 青刺尖果實含有多種萜類成分[18],由于氣體揮發物量與油枯質量有密切關系,青刺尖油枯越多,單位體積中釋放的氣態揮發物質越多,濃度越高.本試驗以單位體積的材料質量表示揮發物的質量濃度(g/cm3),實驗稱取一定質量的青刺尖油枯和陽性對照材料,放入29 cm×19 cm×39 cm透明方形容器,分別同時置入吸脹種子和幼苗.透明方形容器分別放入6.25、12.5、25、50和100 g青刺尖油枯,得到0、0.18、0.36、0.72、1.44和2.88 g/cm3質量濃度的處理結果,其中,0 g/cm3為陰性對照.以富含萜類具有明確的化感作用[18]的黃花蒿為陽性對照材料,將自然風干黃花蒿粉碎,過0.25 mm孔徑篩,稱取100 g放入1 000 mL蒸餾水,25 ℃浸提24 h,5 000 r/min離心15 min,取上清液,備用.每隔24 h,分別將前述效應材料放入透明方形容器,凡士林密封,光照處理30 min.每日記錄實驗材料的胚芽長度,每個處理重復3次.

1.2.3GC-MS的分析測定 取青刺尖油枯適量,蒸汽提取30 min,冷凝收集揮發物,再用配備DB-5 MS柱的AutoSystem XL GC/TurboMass MS分析(30 m×0.25 mm×0.25 μm)樣品,溫度60 ℃持續4 min,氦氣作載氣,以5 ℃/min速率升溫至300 ℃,持續10 min,記錄的質荷比為33～500m/z.利用NIST譜庫檢索實驗獲得質譜圖中顯現的揮發性物質,通過保留指數定性法驗證質譜檢索結果.

1.3 統計與分析用SPSS 20.0進行統計分析,組間比較用方差分析,差異顯著再用LSD多重比較[19],指標用means±std表示;用SPSS的Probit回歸法分別計算,揮發物對豌豆和青稞胚芽長度的IC50值[20].

2 結果與分析

2.1 青刺尖油枯氣態揮發物處理對豌豆胚芽長度的影響按試驗設計連續處理16 d,記錄實驗效應材料的胚芽長度,比較每間隔4 d豌豆胚芽長度的差異性,計算4 d累計平均胚芽長度,結果見表1.

表 1 處理16 d青刺尖油枯對豌豆幼苗胚芽長度的抑制作用(n=30)

從表1可看出,處理1 d,與陰性對照組比較,除0.72 g/cm3中質量濃度組的豌豆幼苗芽平均長度差異性不顯著(P>0.05)外,其他處理組和陽性對照組的差異性都顯著(P≤0.05);與陽性對照組比較,高、中質量濃度的處理組差異性不顯著(P>0.05).處理4 d,與陰性對照組比較,除2.88 g/cm3的豌豆幼苗芽平均長度差異性不顯著(P>0.05)外,各處理組和陽性對照組的4 d累計平均芽長度差異性都顯著(P≤0.05);與陽性對照組比較,高質量濃度處理組的差異性不顯著(P>0.05).處理8 d,與陰性對照組比較,各處理的差異性都顯著(P≤0.05);與陽性對照組比較,高質量濃度的處理組差異性不顯著(P>0.05).處理12 d,與陰性對照組比較,除低質量濃度處理的差異性不顯著(P≤0.05)外,其他處理的差異性都顯著(P≤0.05);與陽性對照組比較,高、中高和中質量濃度的處理組差異性都不顯著(P>0.05).處理16 d,與陰性對照組比較,各處理組、陽性對照組的差異性顯著(P≤0.05);與陽性對照組比較,高、中高和中質量濃度的處理組差異性都不顯著(P>0.05).因此,用青刺尖油枯每日定時處理豌豆幼苗1～16 d,對豌豆幼苗的生長都有顯著抑制作用,此與黃花蒿的抑制效應一樣.

2.2 青刺尖油枯氣態揮發物的質量濃度和處理時間對豌豆幼苗生長的影響以質量濃度為橫坐標,分別以豌豆幼苗長度、日增加長度為縱坐標,得到連續處理1～16 d、不同質量濃度青刺尖油枯氣態揮發物對豌豆幼苗影響的結果,見圖1和圖2.

圖1 不同質量濃度青刺尖油枯對豌豆幼苗長度的影響

圖2 不同質量濃度青刺尖油枯對豌豆幼苗日增加長度的影響

從圖1可以看出,豌豆幼苗對青刺尖油枯氣態揮發物較敏感.同一質量濃度條件下,隨著處理時間的增加,各個質量濃度的青刺尖油枯都對豌豆幼苗的生長抑制作用逐漸增強,導致幼苗的生長緩慢.隨著青刺尖油枯氣態揮發物質量濃度的增加,處理相同時間的抑制曲線在0～1.44 g/cm3下降,但在1.44～2.88 g/cm3卻稍有升高,但仍然低于初始值.與空白組比較,0.18～1.44 g/cm3的各個處理組,豌豆幼苗平均長度均達到極顯著水平(P<0.01);而在1.44～2.88 g/cm3,1～10 d的處理沒有顯著差異,但是在11～16 d的處理有顯著差異性(P≤0.05).因此,青刺尖油枯質量濃度為1.44 g/cm3時,對豌豆幼苗的抑制作用最強.

從圖2可以看出,與空白組比較,各個青刺尖油枯的高低質量濃度處理組都對豌豆幼苗的日增加長度有顯著的抑制作用(P≤0.05).在0.18～1.44 g/cm3與空白對照比較,各處理組的豌豆幼苗的日增加長度差異均達到極顯著(P<0.01),質量濃度2.88 g/cm3時,各處理組的豌豆幼苗日增加長度差異不顯著.因此,青刺尖油枯的質量濃度在1.44 g/cm3對豌豆幼苗日增加長度的抑制作用最強,質量濃度增大到2.88 g/cm3時沒有顯著差異,呈現抑制的飽和現象.

2.3 青刺尖油枯氣態揮發物對豌豆種子芽伸長的影響處理時間為橫坐標,分別以豌豆種子的芽長、日增長量為縱坐標,得到不同質量濃度青刺尖油枯處理對豌豆種子萌發的影響,16 d的結果如圖3和圖4所示.

圖3 不同時間青刺尖油枯氣態揮發物對豌豆種子芽長的影響

圖4 不同時間青刺尖油枯氣態揮發物對豌豆種子的芽長日增加量的影響

從圖3可看出,青刺尖油枯氣態揮發物濃度由低到高的變化過程中,豌豆種子的芽伸長隨著處理時間的增加,均值呈現上升的趨勢.處理1～4 d的曲線較平緩,即豌豆芽長增長較緩慢;處理4～16 d的曲線較陡,即豌豆芽長增長較快.分析比較同一處理時間曲線的變化,可以看出處理的濃度越高,曲線越低矮,呈現出對豌豆種子的芽伸長抑制現象.

從圖4可以看出,陽性對照組第2天的日增加量為(0.48±0.49) cm,第9天的日增加量達到高峰,為(2.07±0.45) cm,第10天的日增加量明顯下降,為(1.20±0.60) cm.1.44 mg/m3中高質量濃度組的日增加量最低,與其他組比較,差異極顯著(P<0.01),第2天的日增加量為(0.78±0.40) cm,第9天的日增加量達到高峰,為(1.28±0.66) cm,第10天的日增加量明顯下降,為(0.88±0.42) cm.因此,青刺尖油枯在1.44 mg/m3中高質量濃度時,對豌豆種子的芽伸長的日增加量抑制作用最強.

2.4 青刺尖油枯氣態揮發物的處理濃度和處理時間對豌豆種子芽伸長的影響回歸分析表明,青刺尖油枯不同處理質量濃度、不同處理時間,對豌豆種子的芽伸長有相關性.可建立“質量濃度、處理時間-芽伸長”方程,并得到方程的決定系數r2=0.734.

l豌豆=-0.802+0.777x+0.005y,

其中,l豌豆表示豌豆芽長(cm),x為提取物處理質量濃度(mg/cm3),y表示處理時間(d).從方程可知,豌豆種子的芽伸長量與青刺尖油枯的質量濃度呈極顯著的正相關,即當處理質量濃度大于1.44 g/cm3時,處理質量濃度越大,豌豆芽長越短.但是,豌豆種子的芽伸長量與處理時間的相關性不高.

青刺尖油枯在不同質量濃度處理和不同處理時間,對豌豆種子的芽伸長日增加量有相關性.建立方程,得到方程的決定系數r2=0.162,此決定系數較低,因此,豌豆種子的芽伸長日增加量與青刺尖油枯質量濃度、處理時間的線性不顯著.

2.5 青刺尖油枯氣態揮發物對青稞幼苗生長的影響按試驗方案連續處理16 d,比較每隔4 d,不同組的青刺尖油枯對青稞幼苗生長的影響,計算4 d累計平均芽長,結果見表2.

表 2 處理4 d青刺尖油枯對青稞幼苗生長的抑制作用(n=30)

從表2可看出,處理1 d青稞幼苗,與陰性對照組比較,除極低質量濃度組外,低、中、中高、高質量濃度和陽性對照的差異性都顯著(P≤0.05);與陽性對照組比較,除極低質量濃度組外,低、中、中高、高質量濃度和陽性對照的差異性都不顯著(P>0.05).處理4 d,與陰性對照組比較,除極低質量濃度處理外,其他處理4 d累計平均芽長的差異性都顯著(P≤0.05);與陽性對照組比較,除極低、低、中高質量濃度組外,中、高質量濃度的差異性都不顯著(P>0.05).處理8、12和16 d,分別與陰性對照組比較,各處理質量濃度和陽性對照的差異性都顯著(P≤0.05);與陽性對照組比較,除中、中高質量濃度組外,其他處理質量濃度組的差異性都不顯著(P>0.05).

因此,用青刺尖油枯每日間斷處理青稞幼苗1～16 d,低質量濃度處理表現為抑制,高質量濃度表現為促進,而對芽生長的抑制作用,與黃花蒿的一樣.

2.6 青刺尖油枯氣態揮發物的質量濃度和處理時間對青稞幼苗生長的影響以質量濃度為橫坐標,分別以青稞幼苗長度、日增加長度為縱坐標,得到連續處理1～16 d、不同質量濃度青刺尖油枯氣態揮發物對青稞幼苗影響的結果,見圖5和圖6.

圖5 不同質量濃度青刺尖油枯對青稞幼苗的影響

圖6 不同質量濃度青刺尖油枯對青稞幼苗日增加長度的影響

從圖5可以看出,青稞幼苗對青刺尖油枯氣態揮發物較敏感.同一質量濃度,隨著處理時間的增加,各個質量濃度的青刺尖油枯都對青稞幼苗的生長抑制作用逐漸增強,導致幼苗的生長緩慢.隨著青刺尖油枯氣態揮發物質量濃度的增加,處理相同時間的抑制曲線在0～0.18 g/cm3呈下降趨勢,但是,在0.18～0.72 g/cm3稍有升高,卻仍然低于初始的數值,在0.72～2.88 g/cm3高于初始的數值.與空白組比較,0.18～0.72 g/cm3的各個處理組,豌豆幼苗平均長度均達到極顯著水平(P<0.01);而在0.18～0.72 g/cm3,1～10 d的處理沒有顯著差異,但是,11～16 d的處理有顯著差異性(P≤0.05).因此,青刺尖油枯質量濃度0.18 g/cm3時,對豌豆幼苗的抑制作用最強.

從圖6可以看出,與空白組比較,各個青刺尖油枯的高低質量濃度處理組,都對豌豆幼苗的日增加長度有顯著的抑制作用(P≤0.05).在0.18～1.44 g/cm3,與空白對照比較,各處理組的豌豆幼苗的日增加長度差異均達到極顯著(P<0.01),質量濃度為2.88 g/cm3時,各處理組的豌豆幼苗日增加長度差異不顯著.因此,青刺尖油枯的質量濃度在1.44 g/cm3對豌豆幼苗日增加長度的抑制作用最強,質量濃度增大到2.88 g/cm3時沒有顯著差異,呈現抑制的飽和現象.

2.7 青刺尖油枯氣態揮發物的不同處理時間對豌豆胚芽伸長的影響以處理時間為橫坐標,分別以豌豆胚芽的長度、日增加長度為縱坐標,得到不同質量濃度青刺尖油枯處理對豌豆種子萌發的影響,結果見圖7和圖8.

部分班組長擅自將其他驗收合格腳手架牌子拆卸，掛于未經驗收合格的腳手架，企圖蒙混過關。項目部制定制度，對于該行為予以嚴格處罰，同時，安排腳手架主管對所有腳手架掛牌情況建立臺賬，只有腳手架主管及腳手架檢查工程師擁有掛牌和移牌權利，掛牌不能使用鐵絲，必須使用腳手架主管的專用工具。最終徹底杜絕了該行為發生，避免企業形象受損。

圖7 青刺尖油枯氣態揮發物對豌豆胚芽長的影響

從圖7可以看出,青刺尖油枯氣態揮發物濃度在由低到高的變化過程中,豌豆胚芽的伸長隨著處理時間的增加,均值呈現上升的趨勢.處理1～9 d的曲線較陡,即豌豆胚芽長增長較快;處理9～16 d的曲線平緩,即豌豆芽長增長較緩慢.分析比較同一處理時間曲線的變化,可以看出處理的濃度越低,曲線越低矮,呈現出對豌豆胚芽伸長的抑制現象.

從圖8可以看出,對照組第2天的日增加量為(1.33±0.54) cm,第7天的日增加量達到高峰,為(2.07±0.45) cm,第8天的日增加量明顯下降,為(0.64±0.59) cm.0.18 mg/m3極低濃度組的日增加量最低,與其他組比較,差異顯著(P≤0.05),第2天的日增加量為(0.91±0.0.36) cm,第7天的日增加量達到高峰,為(2.32±0.91) cm,第8天的日增加量明顯下降,為(0.53±0.39) cm.因此,青刺尖油枯在0.18 mg/m3極低質量濃度時,對豌豆種子的胚芽伸長的日增加量抑制作用最強.

2.8 青刺尖油枯氣態揮發物的處理質量濃度和處理時間對青稞胚芽伸長的影響回歸分析表明,青刺尖油枯的不同質量濃度處理和不同處理時間,對青稞種子的胚芽伸長有相關性.可建立“質量濃度、處理時間-胚芽伸長”方程,計算出方程的決定系數r2=0.162.

l青稞=3.804+0.898x+0.527y,

其中,l青稞表示青稞胚芽長(cm),x為提取物處理質量濃度(mg/cm3),y表示處理時間(d).從方程可知,青稞種子的胚芽伸長量與青刺尖油枯的質量濃度呈極顯著的正相關,即處理質量濃度越大,青稞胚芽的芽長越短.青稞種子的胚芽伸長量與處理時間的相關性不顯著.

青刺尖油枯不同質量濃度處理、不同處理時間,對青稞種子的胚芽伸長日增加量有相關性.建立方程,得到方程的決定系數r2=0.162,此決定系數較低,因此,青稞種子的胚芽伸長日增加量與青刺尖油枯質量濃度、處理時間的線性不顯著.

2.9 青刺尖油枯氣態揮發物對豌豆、青稞幼苗的IC50由于各質量濃度青刺尖油枯對豌豆、青稞幼苗的抑制率不呈線性關系,所以可用SPSS的Probit法分別進行回歸分析[15],得方程:

PROBIT(P)=Intercept+BX,

模型的擬合優度可以用卡方檢驗,再從Probit分析的結果中,可查得IC50值(即P=0.50時,樣品的質量濃度)及其95%置信區間值,結果見表3.

表 3 青刺尖油枯揮發物對豌豆和青稞幼苗的IC50值

試驗結果表明,青刺尖油枯對豌豆、青稞幼苗,IC50值分別為0.752和4.160 μg/mL.IC50值越小,表明抑制作用越強.從試驗結果可知:青刺尖油枯對豌豆幼苗的生長抑制作用強于對青稞幼苗的生長抑制作用.

2.10 青刺尖油枯氣態揮發物的GC-MS分析結果實驗扣除本底的雜質,從青刺尖油枯中測定出40種揮發性物質,主要有萜類、醇類、酯類、烷烴類和氮類等5大類物質,其中,以萜類物質含量最高,也是揮發性物質的主要成分,總離子流如圖9所示,揮發性物質的成分名稱、保留時間和相對質量分數結果如表4所示.

圖9 青刺尖油枯揮發性物質的總離子流

青刺尖種子富含萜類化合物,劉云環[21]從青刺尖莖葉和種子中分離鑒定出多種萜類物質,文獻[8]從青刺尖莖葉分離鑒定出2個三萜類,文獻[9]從青刺尖分離鑒定出9個三萜類,Takaishi等[22]從青刺尖分離鑒定出2個半萜類,Rai等[11]確定了13種單萜.現有研究表明,酚類和萜類是高等植物較為常見的化感物質,萜類化合物在植物生命活動中有重要作用,在天然產物中占比很大,而且單萜類和倍半萜類具揮發性,是植物化感作用的關鍵物質.因此,青刺尖油枯具有化感作用.

本試驗檢測到的鄰苯二甲酸二乙酯等具有化感作用.Keire等[23]報道鄰苯二甲酸二乙酯具有化感作用.Bais等[24]研究表明,相對含量大的物質并不一定有化感作用.由此可以推斷,檢測出的鄰苯二甲酸二乙酯和姜黃烯等物質可能是青刺尖油枯的化感作用的主要成分,但同時,也不排除檢測出的其他物質具有化感作用.植物的化感作用常常是幾個或幾類化合物綜合作用的結果,化感物質之間常常有協同或拮抗作用,鑒定各單體化合物的化感活性及其相互之間的作用還有待于進一步研究.

表 4 青刺尖油枯揮發性物質的主要化學成分及其相對質量分數

3 結論

植物化感作用是近年來的研究熱點,萜類是存在于自然界的一類具有(C5H8)n結構,且具有揮發性的碳氫化合物及其含氧飽和度不同的衍生物總稱,主要通過甲瓦龍酸和異戊烯焦磷酸途徑進行生物合成,是第二大類的化感物質[25].Fischer等[26]總結了萜類化感作用的特點,在自然條件下,對植物的發芽和生長的抑制呈季節性變化,一般在夏季萜類物質的抑制性較強.萜類混合物對發芽具有高抑制作用,但是,其純物質在低質量濃度時具有促進作用,即呈現“低促高抑”的現象.化感作用抑制植物幼苗的正常生長,從而導致植株矮小、瘦弱,影響對光的競爭.因此,作為肥料的青刺尖油枯對豌豆、青稞等經濟作物,其化感作用可能導致產量降低.朱宇林等[27]認為化感物質的處理可影響種子發芽ATP的產生和呼吸作用.大量研究證實黃花蒿對周圍植物有很強的化感作用,對禾本科植物種子的萌發和生長均有抑制作用[28].

本試驗研究采用比較常用的生長和發育測定法[29],在透明密閉的干燥室內用不同質量濃度的青刺尖油枯,對豌豆、青稞幼苗分別進行處理,評價油枯的化感作用,探討其化感作用.結果表明:一定質量濃度的青刺尖油枯,揮發出的氣態物可顯著抑制豌豆種子和幼苗,其生長量和日增加量隨青刺尖油枯質量濃度的升高,抑制作用呈現先高后低的現象.青刺尖油枯在質量濃度0.18～2.88 g/cm3,對青稞和豌豆的幼苗生長有不同影響,對豆科的豌豆,在此質量濃度范圍均表現出抑制效果,而且呈現飽和效應;對禾本科的青稞,低質量濃度表現為抑制,高質量濃度表現為促進作用.GC-MS分析測定結果表明,青刺尖油枯的揮發性成分中萜類物質含量最高,是揮發性物質的主要成分,應該是化感作用的活性物.因為屬于不同科的植物,豌豆和青稞可能對青刺尖油枯中揮發性的化感反應機制有差異性,從而表現出明顯的區別,具體機制有待進一步研究.

致謝 四川師范大學項目(14yb29)對本文給予了資助,謹致謝意!