聚乙烯降解菌白淺灰鏈霉菌LBX-2烷烴羥化酶基因SaalkB的克隆與表達分析

張榕麟, 高田蕊, 陳美菊, 熊 爽, 何欣怡, 雍 彬, 邵歡歡

(四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101)

塑料因其具有強度大、重量輕、柔韌性好、易于生產和成本低廉等特點,被廣泛應用于人類生活、工業生產等各個領域[1].據相關文獻報道,全球塑料年產量約為3億t[2],其中聚乙烯(polyethylene, PE)約占40%,是塑料生產的重要組成部分[3].然而廢棄塑料造成的環境污染問題日益嚴重,隨著時間推移,92.4%的塑料被風化分解為直徑小于5 mm的微塑料,廣泛分布于全球各地,對河流、湖泊、耕地等造成嚴重污染[4],且在海洋、淡水、土壤、陸地生物體內均發現了微塑料的存在,嚴重危害生物體健康[5].PE分子排列緊密、疏水性強、表面能低且化學性質穩定,因此在自然界中很難被降解,導致PE廢棄物在環境中大量積累,如何徹底降解PE廢棄物已經成為一個全球性難題[6].

生物降解PE是一種綠色環保、低能耗的降解方式.通過微生物降解PE將其無機礦化為CO2和H2O,該降解方式極有可能成為減少“白色污染”的有效途徑之一[7].生物降解PE的第一步是PE氧化,由微生物產生胞外酶氧化PE長烴鏈斷裂[8].研究發現烷烴羥化酶、漆酶以及過氧化物酶等多種酶類具有氧化降解PE的能力[9].Zhao等[10]發現過氧化物酶可以顯著提高高密度聚乙烯薄膜的親水性.Santo等[11]發現赤紅球菌分泌的漆酶可降低低密度聚乙烯的分子量及增加酮羰基指數,認為可由漆酶催化打斷聚乙烯長鏈.烷烴-1-單加氧酶(alkane-1-monooxygenase,AlkB)是烷烴羥化酶(alkane hydroxylase,AH)系統的催化組分,參與烴類代謝途徑的第一步,通過末端或次末端氧化降解烴類低聚物.烷烴羥化酶系統包含3個組份,分別是1個非血紅素鐵的膜整合的單加氧酶(alkane-1-monooxygenase,AlkB)和2個電子轉移蛋白紅素氧還蛋白(rubredoxin,AlkG)、紅素氧還蛋白還原酶(rubredoxin reductase,AlkT)[12].Jin等[13]通過實時熒光定量PCR檢測烷烴羥化酶基因alkB表達量,以監測聚乙烯降解菌的豐度.Gyung等[14]將PE降解細菌銅綠假單胞菌E4的烷烴羥化酶基因alkB在大腸桿菌BL21中表達,經80 d堆肥生物降解將低分子量PE近20%的碳礦化為CO2,認為alkB基因在低分子量PE降解過程中發揮重要作用.Jeon等[15]克隆了PE降解細菌銅綠假單胞菌E7的烷烴羥化酶基因alkB并在大腸桿菌中表達,發現在含有低密度PE的培養基中轉錄水平增加了4倍,alkB重組菌株表現出對PE的高生物降解能力,而不含alkB的菌株對PE完全無降解作用,證實了alkB是降解聚乙烯不可或缺的基因.

本實驗室前期從土壤中分離篩選得到一株能夠降解聚乙烯的放線菌——白淺灰鏈霉菌LBX-2,該菌株對淀粉聚乙烯降解15 d的失重率可達26.54%[16].蛋白質組與代謝組數據表明SaalkB基因可能在白淺灰鏈霉菌LBX-2降解PE的過程中發揮重要作用.因此,本研究通過克隆白淺灰鏈霉菌LBX-2烷烴單加氧酶基因SaalkB,對SaalkB基因片段進行測序及序列同源性分析,并對其編碼蛋白氨基酸序列、理化性質、信號肽等進行生物信息學分析.構建SaalkB基因的原核表達載體并進行重組蛋白的原核表達,通過AFM分析重組工程菌株對PE膜片的降解效果;通過熒光定量PCR分析SaalkB基因在聚乙烯降解過程中的表達情況;通過蛋白組數據分析AlkB蛋白在聚乙烯降解過程中的表達情況.本研究可為深入探索SaalkB基因在聚乙烯降解過程中的作用提供理論依據,也為研究白淺灰鏈霉菌LBX-2降解聚乙烯的過程及機制提供思路.

1 材料和方法

1.1 實驗材料白淺灰鏈霉菌LBX-2由本實驗室分離并保存.E.coliDH5α感受態、E.coliBL21(DE3)感受態與原核表達載體pDE1 Directional Expression Kit、DNA凝膠回收試劑盒均購自成都擎科梓熙生物技術有限公司.質粒提取試劑盒購自OMEGA公司.細菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、250 bp DNA Ladder以及TaqPCR Mastermix購自天根生化科技(北京)有限公司.IPTG和卡那霉素購自AMERESCO公司.QPK-201、ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix、TRIzolTMPlus RNA Purification Kit購自toyobo公司.RR047Q反轉錄試劑盒購自TaKaRa.PE粉末(MW=2 000)購自中國石油化工股份公司茂名分公司.PE膜片購自海門市揚子醫療器械有限公司.引物根據SaalkB基因序列與pDE1序列設計,由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成(見表1).

表 1 引物序列

1.2 培養基高氏一號培養基(g/L):可溶性淀粉20.0(用于蛋白質組學分析時為3.0),KNO31.0,NaCl 0.5,K2HPO4·3H2O 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,pH值7.2～7.4.

1.3 白淺灰鏈霉菌LBX-2總DNA和RNA提取采用細菌基因組DNA試劑盒制備白淺灰鏈霉菌LBX-2總DNA.由于白淺灰鏈霉菌LBX-2是革蘭氏陽性菌,且在液體培養基中呈球狀,較難破壁,故先將菌體混合石英砂在液氮中研磨,再按照試劑盒提供的操作步驟提取基因組DNA.白淺灰鏈霉菌LBX-2總RNA利用Trizol法提取,并利用凝膠電泳對其純度和完整性進行檢測;同時使用TaKaRa反轉錄試劑盒進行反轉錄得到該菌株的總cDNA.

1.4 白淺灰鏈霉菌LBX-2SaalkB基因擴增及測序以白淺灰鏈霉菌LBX-2總DNA為模板,alkB-F和alkB-R為擴增引物,擴增SaalkB基因.PCR反應體系為:基因組DNA 1 μL,2×PrimeSTAR GC Buffer(Mg2+plus) 25 μL,PCR Forward Primer(10 μmol/L) 2 μL,PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 1 μL,dNTP Mixtuer(2.5 mmol/L) 4 μL,ddH2O補足至50 μL.擴增條件為:98 ℃預變性2 min,進入循環;94 ℃變性10 s;60 ℃退火5 s;72 ℃延伸30 s;循環32次;72 ℃延伸5 min.

使用DNA純化回收試劑盒回收PCR目的DNA片段,取2 μL目的DNA,依次加入1 μL pDE1 Vector,1 μL 10×Topo Mix,6 μL ddH2O,混勻后20～30 ℃反應5 min,連接產物轉化E.coliDH5α感受態細胞,取200 μL轉化液涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基中,37 ℃過夜培養,挑取單菌落接種至含100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中,37 ℃、180 r/min振蕩培養10～12 h,提取質粒進行PCR驗證.經PCR鑒定為陽性的菌株,送往成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序,對測序正確的菌株進行菌種保藏.

1.5 生物信息學分析將克隆得到的SaalkB基因序列進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)相似性比對分析;AlkB蛋白的理化性質使用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析;應用SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進行AlkB蛋白信號肽預測;使用NPSA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/npsa_automat.pl?page=/NPSA)在線預測AlkB蛋白二級結構;使用Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)在線預測AlkB蛋白三級結構;運用TMPRED(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED/nn.html)預測AlkB蛋白的跨膜結構;應用NCBI中的BLASTP程序對AlkB蛋白進行序列同源性分析,利用軟件MEGA 5.02比對序列,采用近鄰相接法(neighbor-joining method)構建AlkB系統進化樹,氨基酸的進化距離使用Poisson correction模型.

1.6 重組蛋白的誘導表達將測序驗證正確的重組質粒轉入E.coliBL21(DE3)中,使用含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB平板進行篩選,37 ℃過夜培養,挑取單菌落至含100 μg/mL卡那霉素的液體LB培養基中,37 ℃、180 r/min振蕩培養至OD600為0.5時,加入1 mmol/L IPTG,18 ℃低溫誘導表達16 h.取1 mL菌液超聲破碎3～4次至透明,離心取菌體沉淀,加入100 μL上樣緩沖液后取樣進行SDS-PAGE凝膠電泳.

1.7 重組菌株處理PE膜片使用以PE膜片為唯一碳源的無機鹽培養基培養上述構建的重組工程菌株,以空載體E.coliBL21(DE3)作為對照組,每組設3個重復.培養30 d后,從對照組和實驗組的搖瓶中分別回收PE膜片,用蒸餾水清洗膜片數次,再將膜片放入終質量分數為2%的SDS溶液中,超聲清洗2 h后置于37 ℃環境中過夜,然后依次用無水乙醇、ddH2O清洗,干燥后用原子力顯微鏡(AFM, Dimension Icon, Veeco, Billerica, MA, USA)在1.0 Hz的掃描速度下觀察PE膜片表面形貌.

1.8 熒光定量PCR以白淺灰鏈霉菌LBX-2總cDNA為模板,16s-F和16s-R為引物,采用SYBR染料法對SaalkB基因進行相對熒光定量檢測.反應體系為:SYBR Green Realtime PCRMasterMix-plus(2×)10 μL,PCR Forward Primer(10 μmol/L)1 μL,PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL,cDNA 1 μL,Plus Solution 2 μL,ddH2O補足至20 μL.反應條件:95 ℃預變性3 min,進入循環;95 ℃變性15 s;58 ℃退火30 s;72 ℃延伸45 s;循環40次,72 ℃保溫3 min,重復次數n=3.從55 ℃到95 ℃進行溶解曲線分析,去除引物二聚體和其他非特異性擴增.利用iQ 3.1-Cycler分析數據,定量方法為2-ΔΔCt法.

優美的水生態環境，是最公平的公共產品，是最普惠的民生福祉。必須樹立以人民為中心的理念，堅持全民共建、全民共享，廣泛凝聚保護河湖的強大合力。

1.9 AlkB蛋白的表達量分析分別使用以PE粉末為唯一碳源的無機鹽培養基和高氏一號培養基培養白淺灰鏈霉菌LBX-2,每組設3個重復,180 r/min、37 ℃振蕩培養.在LBX-2培養至48 h(指數生長期)和84 h(平臺期)時進行取樣,取菌液于5 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min,收集全部菌體,以PE粉末為唯一碳源培養48 h和84 h的樣品分別標記為PE48h、PE84h,用高氏一號培養基培養48 h和84 h的樣品分別標記為G48h、G84h.對樣品進行蛋白質測序并獲得蛋白質組學數據,通過序列比對和信息注釋找到AlkB蛋白,利用HEML軟件制作熱圖分析其表達量,并比較不同碳源、不同時間組別的AlkB表達量(log2FC轉化后數據)的差異,分別記為PE48h vs G48h、PE84h vs G84h、G84h vs G48h和PE84h vs PE48h.

2 結果

2.1 白淺灰鏈霉菌LBX-2SaalkB基因的克隆以白淺灰鏈霉菌LBX-2基因組DNA為模板,利用引物alkB-F和alkB-R進行PCR擴增,經純化后獲得長度約為1 000 bp的片段(見圖1).

M: DNA分子量標準(DL2 000) ; 1: SaalkB基因的PCR擴增產物

2.2SaalkB基因的生物信息學分析

2.2.1SaalkB編碼蛋白的核苷酸序列及氨基酸序列分析 白淺灰鏈霉菌LBX-2的alkB基因通過PCR擴增后,對其進行膠回收、克隆并測序,經測序后發現該基因長度為1 086 bp(NCBI GenBank索引號:OL804209),通過DNAMAN軟件分析獲得該基因編碼蛋白質共具有361個氨基酸,且具有一個脂肪酸脫飽和功能域,該功能域長度為585 bp,起始位點為第316 bp,終止位點為第900 bp.

2.2.2SaalkB編碼蛋白的理化性質分析 理化性質分析顯示SaalkB基因編碼蛋白共有361個氨基酸,分子式為C1851H2837N547O491S10,分子量為40.9 kDa,等電點(isoelectric point, pI)為10,不穩定系數為60.74,是一種不穩定的蛋白質,脂肪疏水系數為88.12,親水性平均系數(GRAVY)為-0.209,屬于親水性蛋白.

2.2.3SaalkB編碼蛋白的二級和三級結構預測 NPSA預測得到SaalkB編碼蛋白的二級結構(見圖2),其中α螺旋(alpha helix)、β折疊(beta folding)、無規則卷曲(random coil)所占比例分別為39.34%、9.42%、51.25%.因此,AlkB蛋白主要由無規則卷曲組成,其次為α螺旋,再次為β折疊.

利用Swiss Model同源構建模型預測AlkB蛋白的三維結構模型(見圖3),該蛋白三級結構中僅有部分α螺旋和少量的β折疊,大部分由無規則卷曲組成,整體結構比較疏松,與蛋白質二級結構預測基本一致.

圖3 SaalkB編碼蛋白三級結構預測

2.2.4SaalkB編碼蛋白信號肽及跨膜結構分析 Signal IP 3.0分析發現SaalkB編碼蛋白不存在信號肽序列(見圖4),屬于非分泌蛋白.

圖4 SaalkB編碼蛋白信號肽分析

TMpred軟件預測SaalkB編碼蛋白含有5個跨膜結構域(見圖5),分別為氨基酸第10～35位(跨膜方向由內向外)、氨基酸第62～85位(跨膜方向由內向外)、氨基酸第87～110位(跨膜方向由外向內)、氨基酸第205～229位(跨膜方向由內向外)、氨基酸第305～325位(跨膜方向由外向內),表明SaalkB編碼蛋白屬于跨膜蛋白.

2.2.5SaalkB編碼蛋白的系統進化分析 系統進化分析結果表明:經克隆獲得的SaalkB編碼氨基酸序列與Stretomycessp. XY006、Streptomycessp. B9173、Streptomycessp. CB01883以及Streptomycesaureus的alkB編碼氨基酸序列親緣關系最近(見圖6),這一結果與alkB編碼蛋白的物種分類系統的結果較為一致.

圖6 SaalkB編碼蛋白的系統進化樹

2.3 原核載體構建及表達分析從轉入重組質粒的E.coliDH5α中提取含有SaalkB基因的重組質粒pDE1(見圖7)并進行PCR驗證,片段大小與目的基因大小相同(見圖8),證明含有SaalkB基因的原核表達載體pDE1-alkB構建成功.

M: DNA分子量標準(DL5 000); 1: 重組質粒pDE1-alkB.

M: DNA分子量標準(DL5 000); 1: 重組質粒pDE1-alkB驗證PCR.

經終濃度為1 mmol/L IPTG誘導的含有SaalkB基因的原核表達載體pDE1-alkB在E.coliBL21 (DE3)中成功表達(見圖9),分子量約40 kDa,與預期的目標蛋白大小一致(40.9 kDa),表明在1 mmol/L IPTG誘導下,SaalkB基因在大腸桿菌中能夠進行過表達.

M: 蛋白Marker; 1: 空載體轉化菌誘導表達產物; 2: 重組質粒轉化菌誘導表達產物.

2.4 重組菌株對PE膜片的處理作用AFM圖像顯示重組工程菌株處理30 d后PE膜片局部降解,膜片上形成了明顯的溝槽、凹陷和輕度侵蝕,粗糙程度高(見圖10B),而對照組PE膜片相對更加平滑,雖有凹陷,但粗糙程度低(見圖10A),表明重組工程菌株能夠降解PE,通過與PE膜片表面的物理接觸改變了聚合物表面的完整性,進一步表明SaalkB基因可能在聚乙烯降解過程中發揮重要作用.

圖10 PE 膜片表面形貌的AFM測試

2.5 熒光定量PCR分析利用Trizol法提取白淺灰鏈霉菌LBX-2總RNA,反轉錄為cDNA進行熒光定量PCR,分析白淺灰鏈霉菌LBX-2在以PE粉末為唯一碳源的無機鹽培養基中和在高氏一號培養基中SaalkB基因的表達水平,每組設3個重復.結果表明,在以PE粉末為唯一碳源的培養基中SaalkB基因的表達量約為在高氏一號培養基中的30倍(見圖11),證明了SaalkB基因可能在白淺灰鏈霉菌LBX-2降解聚乙烯的過程中具有重要的作用.

A: 高氏一號培養基中SaalkB基因表達量;

2.6 AlkB蛋白的表達量分析蛋白質表達量熱圖顯示白淺灰鏈霉菌LBX-2的AlkB蛋白在PE48h和PE84h中的表達量顯著高于G48h和G84h(見圖12A),通過表達量log 2FC轉化后的數據進行差異顯著性分析,白淺灰鏈霉菌LBX-2在以PE為唯一碳源培養48 h和84 h時,AlkB蛋白的表達量比在高氏一號培養基中分別上調了2.35和1.57倍(圖12B),表明AlkB蛋白可能參與了與PE降解相關的代謝途徑,證明了SaalkB基因可能在白淺灰鏈霉菌LBX-2降解聚乙烯的過程中具有重要的作用.

A: 不同培養條件下AlkB蛋白表達量,橫坐標表示3個重復S1-S3,縱坐標表示不同培養條件,深色表示上調,淺色表示下調;

3 討論

自20世紀以來,隨著塑料產品不斷大規模生產,塑料廢棄物由于處理不當,長期大量積累造成“白色污染”,嚴重危害生態環境的健康發展[17].目前,已有許多研究報道了微生物降解PE的潛力,分離出若干能利用PE為唯一碳源生長的菌株.然而,大多微生物存在降解率低以及降解需要預處理PE等問題,且降解速率受PE結晶度、氧化程度和分子量大小等多種因素的影響[18].白淺灰鏈霉菌LBX-2是一種好氧和高G+C含量(質量分數72.47%)的革蘭氏陽性菌,能夠利用PE作為唯一碳源,降解PE薄膜第15天薄膜表面出現皺褶和凹痕,第30天出現明顯可見的破損,第45天出現孔洞,對分子量為5 000和10 000的PE粉末降解15 d的降解率分別為17.27%±0.48%、13.03%±0.74%[19].本研究成功地從白淺灰鏈霉菌LBX-2基因組克隆了SaalkB基因,其長度為1 086 bp,編碼361個氨基酸,脂肪酸脫飽和功能域長度為585 bp,與PseudomonascitronellolisUAM-Ps1和Alcanivoraxsp. 2B5的alkB基因大小相似[20-21].對AlkB蛋白進行理化性質分析、信號肽、蛋白質二級和三級結構預測,結果表明,AlkB蛋白是一種分子量為40.9 kDa、具有5個跨膜結構域(見圖5)且無信號肽(見圖4)的不穩定型親水蛋白;二級結構預測結果可知其主要由無規則卷曲和α螺旋組成(見圖2).系統進化分析結果表明,AlkB蛋白氨基酸序列與Stretomycessp. XY006、Streptomycessp. B9173、Streptomycessp. CB01883以及Streptomycesaureus的alkB編碼氨基酸序列親緣關系最近,其中與Stretomycessp. XY006的alkB編碼氨基酸序列相似性為100%(見圖6).

大腸桿菌外源蛋白表達系統是生產外源蛋白的最優選系統[22-23].本研究成功構建了SaalkB基因的原核表達載體pDE1-alkB(見圖7),通過SDS-PAGE凝膠電泳在大腸桿菌BL21中過量誘導表達得到分子量大小與預測一致的AlkB蛋白(40.9 kDa)(見圖9),與Pseudomonascitronellolis的AlkB蛋白(42 kDa)分子量相近[20].但Al-Kanany等[24]將Pseudomonasaeruginosa的alkB基因在大腸桿菌BL21中表達,經IPTG誘導得到分子量為46 kDa.Luo等[25]發現從PseudomonasputidaGPo1中克隆得到的alkB基因在大腸桿菌中經不同濃度的柴油誘導表達,其分子量為51 kDa.可見不同菌株來源的AlkB蛋白分子量大小存在一定差異,可能與編碼基因的大小或組成不同有關.來自Pseudomonassp. E4、PseudomonasaeruginosaE7的烷烴羥化酶基因alkB在大腸桿菌BL21中表達,80 d的堆肥降解結果表明重組工程菌株均對低分子量PE粉末具有降解作用,而空載體菌株無降解作用[14-15],證實了alkB對低分子量PE的降解能力.本研究中30 d的降解實驗同樣發現重組工程菌株能夠降解PE,AFM觀察PE膜片表面形成明顯的溝槽、凹陷(見圖10).通過熒光定量PCR分析發現,白淺灰鏈霉菌LBX-2在以PE粉末為唯一碳源的培養基中SaalkB基因的表達量約為在高氏一號培養基中的30倍(見圖11),這與Kong等[26]發現AcinetobacterpittiiSW-1的alkB基因在以長鏈正構烷烴C20作為唯一碳源時轉錄水平提高78.28倍且通過RT-qPCR證實了C20顯著誘導alkB表達,以及楊劼等[27]通過熒光定量PCR證明Acinetobactersp. Tust-DM21降解石油與alkB基因的上調表達相關具有一致性.通過蛋白質組學數據分析發現白淺灰鏈霉菌LBX-2在以PE為唯一碳源培養48 h和84 h時AlkB蛋白的表達量比在高氏一號培養基中分別上調了2.35和1.57倍(見圖12),這與劉環[28]分析PseudomonasaeruginosaStrain SJTD-1蛋白質組數據發現烷烴羥化酶AlkB2在有烷烴誘導時表達量上調4倍的結果具有一致性.也有研究發現AlkB參與聚苯乙烯塑料降解的第一步,可以催化聚苯乙烯羥基化[29].由此可以推測alkB不僅是聚乙烯降解過程中的關鍵酶基因,也可能在其他塑料降解過程中起著重要作用.

本研究從白淺灰鏈霉菌LBX-2基因組克隆得到了SaalkB基因,并對其進行了生物信息學分析,為進一步探討該基因的表達提供理論依據.此外,構建含有SaalkB基因的原核表達載體pDE1-alkB并在大腸桿菌內成功表達,且重組工程菌株具有降解PE的能力.熒光定量PCR分析SaalkB基因在PE降解過程中的表達情況,蛋白質組分析AlkB蛋白在PE降解過程中的表達情況,證明了SaalkB基因可能在白淺灰鏈霉菌LBX-2降解PE過程中起重要的作用.為進一步研究AlkB蛋白在聚乙烯降解過程中的功能以及深入探索白淺灰鏈霉菌LBX-2降解聚乙烯的機制提供理論支撐.

致謝四川師范大學“大學生創新性實驗計劃”項目(S201910636417)和四川師范大學開放實驗項目(KFSY2018046)對本文給予了資助,謹致謝意.