中藥對急性熱應激小白鼠肺、腎臟的熱休克蛋白70及熱休克因子1表達量的影響

段凱文，黃小紅，李 莉，鄧海英，江俊勇

（江西生物科技職業學院，江西南昌 330200）

熱應激是環境溫度超過等熱區中舒適區的上限溫度所致的應激反應，機體必須通過化學調節方式來減少產熱，因而引起一系列的內分泌變化，嚴重影響動物的機能代謝和生產性能。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是機體受到應激原刺激后產生的蛋白質，是生物熱休克反應的主要標志；在其家族中，熱休克蛋白70（HSP70）是最重要的一種蛋白質，具有分子伴侶作用，能幫助其他蛋白質進行正確的折疊、組裝、轉運，介導錯誤折疊的蛋白質進行降解（Eschmid，2012 ；Haslbeck，2002），同時還能提高細胞抗應激能力，增加細胞熱耐受能力（Parcellier，2005）。因此，研究HSP 在熱應激畜禽體內發生的動態變化以及如何利用HSP 保護動物機體抵抗熱應激成為研究重點。本研究通過比較中藥復方一、復二、復方三、紫錐菊與王老吉對急性熱應激小鼠肺、腎臟組織HSP70 及HSF1 表達量的影響，探索中藥復方防治熱應激的作用機制，并探討中藥對HSP70表達調控機制，為抗急性熱應激中藥的研究與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗中藥 復方一由藿香、香薷、生石膏、車前草等6 味中藥組方；復方二由紫蘇、薄荷、地膽草等6 味中藥組方；復方三由生石膏、紫錐菊、藿香、紫蘇等6 味中藥組方，單方為紫錐菊。各種中草藥各取30 g，加水300 mL 煎煮，沸后文火煮2 h，紗布過濾，濾液用旋轉蒸發器濃縮到20 mL，使中藥濃度為1.5g/mL。藥液均經流通蒸汽滅菌30 min，4℃冰箱保存備用，共獲得3 種復方中草藥濃縮液和紫錐菊濃縮液。

1.2 主要試劑和儀器 熱休克蛋白70 定量測定試劑盒與熱休克因子1 定量測定試劑盒均購自美國RB 公司。王老吉購自奇康超市。主要儀器有Multiskan Mk3 酶標儀，DY89 Ⅱ型電動玻璃勻漿機，TGL-16B 型臺式離心機，SP-01 型生化培養箱，分光光度計。

1.3 試驗動物分組與處理 試驗將90 只6 ～7周齡健康SPF 級昆明小白鼠隨機分為復方一組、復方二組和復方三組、紫錐菊組、王老吉組、陽性空白對照組，陰性空白對照組，每組10 只。試驗動物常規飼養，經1 周預試期后進入正式試驗。試驗1 ～5 組分別灌胃中藥復方一、中藥復方二、中藥復方三、紫錐菊、王老吉，試驗5 組只飼喂基礎日糧。其中藥物組和陽性對照組試驗期間溫度為40℃，相對濕度為60% ～80%、試驗時間分為1 h、3 h。

1.4 樣品采集與處理 在試驗的第1、3 小時，每組取5 只小白鼠，剖殺取肺臟和腎臟，液氮速凍后于-20℃保存待測。稱取肺臟和腎臟各0.2 g，剪碎（冰水浴中操作），加入組織塊重量9 倍的勻漿介質（0.9% 冷生理鹽水），用勻漿機3000 r/min 處理30 s，使細胞破碎后，3500 r/min 離心5 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。

1.5 樣品檢測方法 HSP70ELISA 檢測試劑盒測定肺臟和腎臟組織HSP70 表達量，HSF1ELISA檢測試劑盒測定肺臟和腎臟組織HSF1 表達量，測試步聚按照試劑盒說明書完成。

1.6 數據統計與分析 試驗數據采用SPSS

13.0 統計分析軟件進行單因素方差分析，采用Duncan’s 法進行多重比較，結果用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 對肺、腎臟HSP70 含量的影響

2.1.1 對肺臟HSP70 的含量影響 由表1 可知，在應激1 h 時，復方三HSP70 表達量極顯著高于陰性對照組，略高于陽性對照組。復方一、復方二及王老吉組均略高于陰性對照組，但略低于陽性對照組。在應激3 h 時，復方一、復方二雞和紫錐菊組HSP70 表達量較1 h 有所增加，而復方三，王老吉及陽性對照組均有所下降。其中復方一和復方二HSP70 表達量均極顯著高于陽性對照組和陰性對照組，復方三極顯著高于陽性對照組，紫錐菊和王老吉組均顯著高于陽性對照組。其中復方二的作用最顯著，可能是因為復方二中紫蘇宣肺利氣，發汗解表作用得到發揮。陽性對照組HSP70 表達量下降幅度最大。

表1 中藥對急性熱應激小鼠肺臟HSP70 含量的影響 ng/L

2.1.2 對腎臟HSP70 含量的影響 由表2 可知，熱應激1 h 時，HSP70 的表達量比陰性對照組有所降低，而到3 h 時有所增加，普遍超過了陰性對照組。在應激3 h 時，復方一、復方二和復方三HSP70 的表達量均極顯著高于陽性對照組和陰性對照組，紫錐菊組極顯著高于陰性對照組，王老吉則顯著高于陰性對照組。其中復方一的提升作用顯著，這可能與車前草利水通淋，清熱解毒作用關系密切。

表2 中藥對急性熱應激小鼠腎臟HSP70 含量的影響 ng/L

2.2 對肺、腎臟HSF1 含量的影響

2.2.1 對肺臟HSF1 含量的影響 由表3 可知，用藥組在應激3 h 時HSF1 表達量均高于1 h 的。在應激1 h 時，各組HSF1 表達量的差異不顯著（P＞0.05）。應激3 h 時，復方二極顯著高于陰性對照組（P＜0.05），陽性對照組顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。

表3 中藥對急性熱應激小鼠肺臟HSF1 含量的影響 ng/L

2.2.2 對腎臟HSF1 的含量影響 由表4 可知，各組在3 h 時HSF1 表達量均低于應激1 h 時。在1 h 時，陽性對照組HSF1 的表達量最高，其次是王老吉組和復方三組。其中復方一、復方二和紫錐菊組極顯著低于陽性對照組。在3 h 時，各組HSF1 表達量均有下降，但陽性對照組仍然高于其他各組。其中復方一和復方二極顯著低于陽性對照組。

表4 中藥對急性熱應激小鼠腎臟HSF1 含量的影響 ng/L

3 討論

3.1 對肺臟和腎臟Hsp70 含量的影響 肺腎之間存在相互滋生的關系，肺屬金，腎屬水，金能生水，肺陰下達于腎可滋養腎陰；腎陰為一身陰液之根本，故腎陰亦可上濟于肺以滋養肺陰，這又叫“金水相生”。根據五行理論，肺金和腎水是母子關系。在生理功能中，肺和腎互相配合、互相影響，這就叫“肺腎相生”。在病理方面，肺氣虛損可以導致腎氣衰弱，即“母病及子”。相反，腎氣衰弱也可以導致肺虛，則為“子病累母”。此病初起，由口鼻而入，肺先受之。濕熱之邪由體表外感而入，由表入里，侵犯中焦，蘊脾生熱，脾胃積熱與濕交困，浸淫肌膚，或濕熱久蘊于下，損傷腎氣。本試驗結果表明，在3 h 時，肺臟和腎臟的HSP70 表達量上升，且腎臟上升明顯，Emami（1991）等研究發現，大鼠腎臟42℃ 15 min 熱應激后HSP70 逐漸增加，4 ～6 h 達到高峰，與本試驗結果相同。HSP70 可作為熱應激的生物標志物（Kumar，2003），隨熱應激時間的增加，熱應激對機體的影響由表及里，由上焦傳至下焦。HSP70 表達的增強是細胞保護作用的體現，本試驗數據表明，復方三和王老吉組HSP70 表達量不升反降，可知復方一和復方二的抗應激效果較復方三的效果好。

3.2 對肺、腎臟HSF1 含量的影響 HSF1 是基本結構蛋白，應激時通過可逆過程形成三聚體，與HSE 結合并激活HSP70 基因的轉錄。在非應激狀態下，細胞質中HSP70 蛋白和HSF 結合形成HSF-HSP70 復合物，此時HSF 沒有活性。當受到應激時，由于變性蛋白增多，與HSF 競爭結合HSP70，大量HSP70 與變性蛋白結合，導致HSF 從HSF-HSP70 復合物中釋放出來，此時游離的HSF 在蛋白激酶或其他激酶的作用下發生磷酸化，形成有活性的三聚體，并轉入核內（Pratt等，1997），在核內與熱休克基因上游啟動子區的HSE 序列結合，進一步被激酶磷酸化（Price，1992），然后啟動熱休克基因的表達。這一反應非常迅速，在受熱后數分鐘可達最高水平，約為應激前的10 ～20 倍。當HSP70 累積到一定程度時又與HSF 結合，HSF 和HSE 分離，抑制此轉錄過程，從而實現反饋抑制熱休克反應。

本試驗結果表明，中藥能有效提高肺臟HSF1的表達量，但腎臟的HSF 表達量呈下降趨勢，可能在應激3 h 時，腎臟HSP70 的含量升高到一定程度，與HSF 結合，反而抑制HSF1 的表達。

3.3 中藥對熱應激的治療作用 夏季高溫高濕產生的熱應激在中醫理論上屬溫熱證范疇。暑濕是其中重要致病因素，《素問·至真要大論》中指出：“夫百病之生也，皆生于風寒暑濕燥火，以之化之變也。”暑性同火烈為陽邪，濕性重濁黏滯為陰邪。暑本熾盛，有得濕助，其熱更熾；濕得暑蒸，其勢更橫。正如《濕熱條辨》所說“夫熱為天之氣，濕為地之氣，熱得濕愈熾，濕得熱愈橫。濕熱兩分，其病輕而緩；濕熱兩合，其病重而速”。因此，用藥上以清輕涼潤、甘寒、咸寒為主，分別采用解表、清熱、涼血、滋陰等方法（劉忠杰，2006）。武果桃等（2019）研究表明，復方中藥可提高肉仔雞機體細胞熱耐受水平，提高生產性能。本試驗3 個中藥復方均以清熱利濕為基本擬方原則，注重肺金養腎水這一治則，并有所側重地篩選各種藥物以組成方劑，如復方一中香薷行水消暑，藿香清理水道，車前草利水通淋。復方二中紫蘇宣肺利氣，發汗解表；薄荷性涼，疏散風熱；陳皮行氣導水；淡竹葉配伍諸藥則清熱利尿，復方三生石膏清實熱，蒼術燥濕，并加紫錐菊以增強機體免疫力。三組復方中，復方二能顯著提高肺臟的HSP70 和HSF1 的含量，可能與組方中紫蘇和薄荷的功效有關。費楓和劉銳（2023）研究表明，飼料添加薄荷提取物有助于提高熱應激條件下斷奶仔豬HSP70基因的表達量，與本試驗結果一致。