高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中的甲苯咪唑及其代謝物殘留量

索紋紋，李小玲，劉伶俐，楊霄，萬譯文

（1.湖南省水產科學研究所，湖南長沙 410153；2.農業農村部漁業產品質量監督檢驗測試中心（長沙），湖南長沙 410153）

甲苯咪唑（Mebendazole，MBZ）又名甲苯噠唑、安樂士，屬于苯并咪唑類的廣譜殺蟲劑，對防治動物體內寄生蟲病有良好效果（胥寧等，2022 ；Ji 等，2020 ；Kulik 等，2011 ；Kim 等，1998），被廣泛用于水產養殖業中。甲苯咪唑在動物體內的主要代謝產物是氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑。為了加強獸藥殘留監控，保證食品安全，我國在2019 年頒布的國家標準（GB 31650-2019 食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量）中規定甲苯咪唑在動物源性肌肉中最高殘留限量為60μg/kg。

目前對甲苯咪唑及其代謝物檢測多采用高效液相色譜法（朱珊珊等，2021 ；郭延萍和劉永玲，2021 ；于慧娟等，2010 ；姜朝軍等，2009）和高效液相色譜-串聯質譜法（溫海濱等，2021 ；陳思敏等，2020 ；陳瑞等，2020 ；翟紋靜等，2018 ；），這兩種方法各有優勢。高效液相色譜法成本低，在全國應用較廣，對單個目標物的定量較為準確；高效液相色譜質譜聯用儀有更高的靈敏度和選擇性，抗干擾能力強，能獲得更低檢出限，定性能力強。本文建立了HPLC 與HPLC-MS/MS 法測定飼料中甲苯咪唑及其代謝物的分析方法，為政府部門對飼料中藥物殘留監控和質量安全評價提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 TSQ Quantum Access 高效液相色譜- 串聯質譜儀；waters e2695 高效液相色譜儀；高速冷凍離心機；渦旋混勻儀；超聲波清洗器；氮吹儀；精密電子天平。

甲酸、乙腈、乙酸乙酯、甲醇為色譜純；磷酸二氫銨、三乙胺（分析純）；DSPE EMR-Lipid 過濾柱；EMR polish 粉包。

甲酸/ 乙腈提取液：將甲酸與乙腈按5 ：95%（V/V）配置。溶解液：將乙腈和磷酸二氫銨以2 ：8 的比例充分混合。

甲苯咪唑及其代謝物標準品（純度均＞97.1%）。使用時根據需要分別采用空白基質液同步前處理或直接經流動相配置成標準工作液，現配現用。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取 準確稱取飼料樣品5.00 g（精確到0.02 g）至50 mL 具塞試管中，加入10 mL 甲酸/乙腈提取液，渦旋振蕩混勻后采用超聲提取10 min，于8000 r/min 離心5 min，將上清液轉至20 mL的具塞帶刻度管中，用10 mL 甲酸/ 乙腈提取液對殘渣重復提取1 次，合并提取液定容至刻度，混勻備用。

1.2.2 凈化 取5mL 上清液至EMR-Lipid dSPE管中并渦旋混勻5 min，另取50 mL 離心管，轉入已經過EMR 凈化后的上清液，加入EMR polish粉末包后渦旋混勻2 min，經6000 r/min 離心5 min。移取2 mL 上清液于10 mL 離心管中，于40℃氮氣吹至近干。準確加入2.0 mL 溶解液，混勻后超聲振蕩1 min 溶解殘渣，過0.45μm 濾膜，供HPLC 測定。當采用HPLC-MS/MS 測定時，殘渣采用1 mL 的20% 乙腈水溶液溶解，混勻后過0.22μm 濾膜供上機測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 高效液相色譜法 色譜柱為X-Bridgr C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；紫外檢測波長為289 nm；柱溫為40℃；流速為1.0 mL/min ；進樣量為30μL；流動相A 為乙腈，B 為0.05 mol/L的磷酸二氫銨- 三乙胺溶液，采用梯度洗脫程序為：0 ～18 min，20% B ；18.01 ～20 min，40%B；20 ～20.1 min，40%～20% B；20.1 ～25 min，20% B 保持5 min。流速為200μL/min。

1.3.2 高效液相色譜串聯質譜法

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱為phenomenex kinetex C18 柱（100×2.1mm，2.6μm）；柱溫為40℃。流動相A 為0.1% 甲酸溶液，B 為乙腈；采用液相梯度洗脫程序為：0 ～1 min，20% B ；1.1 ～4 min，20% B ～70% B ；4.1 ～8 min，70% B ；8.10 min，70% B ～20% B 保持2 min。進樣量為10μL，流速為200μL/min。

1.3.2.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI）；選擇反應監測模式（SRM）；正離子采集模式；噴霧電壓為3500 V ；蒸發溫度為300℃；離子傳輸管溫度為350℃；鞘氣壓力為208 Pa，輔助氣壓力為104 Pa，碰撞氣壓力0.2 Pa。優化后的其他質譜采集參數見表1。

表1 甲苯咪唑及其代謝物的質譜分析參數

2 結果與討論

2.1 提取液的選擇與優化 由于甲苯咪唑及其代謝物難溶于水，所以文獻中常用的提取溶劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯等。試驗發現當飼料樣品在堿性條件下采用乙酸乙酯進行提取時，樣品不易分散，易黏結成團，提取效率較低。采用酸化乙腈可沉淀蛋白，減少對目標物的干擾。

2.2 凈化方式的選擇與優化 QuEChERS 法能快速高效的去除樣品中的雜質，本文選用的EMR polish 粉包含有EMR 吸附劑，能有效去除飼料中的蛋白質、脂類、色素等雜質，可節約60% 試劑，減少前處理時間，提高了檢測效率，也獲得了較好的回收率。樣品濃縮對比了旋蒸和氮吹兩種方式。采用旋蒸時，旋蒸瓶中液體會發生鼓泡現象，造成待測物損失，且瓶壁上會殘留油污，不易清洗。在40℃水浴條件下采用氮吹的方式進行濃縮，可獲得良好的回收率和重現性。

2.3 色譜條件的選擇與優化 在HPLC 法中，采用乙腈-0.025 mol/L 的乙酸銨溶液作為流動相，同時添加1 mL 三乙胺作為減尾劑，有利于目標物分離，使峰形更尖銳，對稱性更好。HPLC 色譜圖見圖1。在HPLC-MS/MS 法中流動相均采用乙腈-0.1% 甲酸，各目標物在色譜柱上分離度高、峰形比較尖銳且噪音小，色譜圖見下圖2。

圖1 甲苯咪咪及其代謝物的混合標準溶液色譜峰（1.0μg/mL）

圖2 甲苯咪咪及其代謝物混合標準溶液的SRM 譜圖（20μg/L）

2.4 方法線性范圍 考慮到HPLC-MS/MS 檢測基質效應的影響，由于同位素內標昂貴不易得到，本方法采用向空白樣品添加不同濃度標準物質，同步前處理操作，獲得含有基質干擾的標準曲線來定量，同時減少進樣體積來消除基質效應，可獲得滿意的結果，見表2、表3。各目標物的濃度和色譜峰面積線性關系符合要求。

表2 高效液相色譜峰線性關系、檢出限及定量限

表3 高效液相色譜串聯質譜法峰線性關系、檢出限及定量限

2.5 方法檢出限與定量限 以3 倍和10 倍信噪比分別確定甲苯咪唑及代謝物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），采取往空白樣品中添加逐級稀釋不同濃度的標準溶液按照本方法進行測定來確定信噪比，結果見表3 和表4。

表4 空白基質中HPLC 與HPLC-MS/MS 平均回收率及精密度（n=6）

2.6 方法回收率與精密度 方法回收率采用在空白基質樣品中添加標準的方法來判定。目標物各添加3 種梯度的標準溶液，每個梯度6 個平行，按1.2 節所述條件進行加標回收率測定，分別用HPLC 和HPLC-MS/MS 法進行測定。回收率和相對標準偏差詳見表4。結果表明，甲苯咪唑及其代謝物在HPLC 和HPLC-MS/MS 法測定的回收率（77.8%～112.1%）和精密度（3.09%～7.28%）滿足要求，適合飼料中甲苯咪唑及其代謝物殘留的測定。

3 小結

本文對提取液的選擇、樣品凈化方式、濃縮方法及色譜條件等進行了優化，建立了飼料中甲苯咪唑及其代謝物的檢測方法。通過方法學驗證，該方法可準確監測飼料中甲苯咪唑及其代謝物殘留量，為飼料中甲苯咪唑及其代謝物的風險監測、風險評估提供高效可靠的技術分析手段。