水稻秸稈發酵飼料中微生物群落結構與功能分析

湯佩芬，李三要

（1.邵陽職業技術學院，湖南邵陽 422000；2.邵陽市林業綜合服務中心，湖南邵陽 422000）

我國是農業大國，每年能產生6 億～8 億t農作物秸稈，占世界秸稈總產量的20% ～30%，其中以玉米、小麥和水稻秸稈為主（張湘云和劉利珍，2022）。目前，農作物秸稈的主要用途包括以下4 個方面：（1）用于造紙的原料；（2）作為粗飼料；（3）秸稈還田；（4）焚燒等其他途徑（曾輝等，2017）。有研究認為，水稻秸稈具有一定的飼用潛力，可作為草食動物優質的粗飼料，但水稻秸稈中粗纖維等不易消化的營養素含量較高，適口性差，直接添加過量的水稻秸稈極易導致畜禽生產性能下降（曾輝等，2017）。因此，使用益生菌、纖維素酶、木聚糖酶等對水稻秸稈進行發酵處理是目前飼料行業的研究重點（許宇薇，2012）。有研究表明，使用益生菌對玉米秸稈進行發酵處理能有效降解纖維，提高蛋白含量（王亦聞等，2020），此外，在使用益生菌的基礎上額外添加纖維素酶、木聚糖酶等生物活性酶制劑能進一步改善發酵質量（韓穎潔，2015）。

因此，本文以水稻秸稈為原料，研究復合發酵試劑對發酵水稻秸稈營養成分和微生物群落結構的影響，為合理利用秸稈資源和發酵飼料的制備提供參考。

1 材料方法

1.1 發酵試劑 本試驗所用水稻秸稈購置于湖南某飼料公司。水稻秸稈發酵試劑參考Hu 等（2020）的試驗，其成分由枯草芽孢桿菌（活菌數≥1×1011CFU/g，江西某生物科技有限公司）、糞腸球菌（活菌數≥1×1011CFU/g，江西某生物科技有限公司）、纖維素酶（酶活力≥10000 U/g，山東某生物有限公司）和木聚糖酶（酶活力≥10000 U/g，山東某生物有限公司）組成，添加比例為1 ∶1 ∶10 ∶30，對照組僅噴灑等體積蒸餾水，發酵試劑與水稻秸稈混勻后置于密封袋中儲存14 d。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 全株玉米青貯營養水平分析 各樣本粗蛋白質（CP）含量的測定使用FOSS 全自動凱氏定氮儀；粗脂肪（EE）含量的檢測使用索氏抽提法；粗纖維（CF）、酸性洗滌纖維（ADF）和中性洗滌纖維（NDF）的測定參考美國分析化學協會（AOAC）。

1.2.2 微生物分析 樣品制備后干冰保存送至北京諾禾致源生物科技有限公司進行后續試驗，使用試劑盒提取各樣本中微生物組DNA，使用引物獲得16S rRNA 基因V3 ～V4 高變異區，構建文庫后進行雙末端測序，測序平臺為Illumina NovaSeq。

1.2.3 數據統計與分析 所有原始數據使用Excel 進行預處理，使用SAS 9.4 進行方差分析，使用T-test 對數據進行分析，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05 表示組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵對水稻秸稈營養成分的影響 由表1 可知，與未發酵水稻秸稈相比，發酵處理顯著提高了水稻秸稈中粗蛋白質含量和活菌數（P＜0.05）；顯著降低了粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量（P＜0.05）。

表1 發酵對水稻秸稈營養成分的影響（風干基礎）

表2 發酵對水稻秸稈微生物α 多樣性的影響

2.2 發酵對水稻秸稈微生物α 多樣性的影響 由species、Shannon、Chao 1 和Ace 指數顯著升高（P＜0.05）；與對照組相比，發酵處理對Simpson 指數無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 發酵對水稻秸稈微生物在門水平上的影響 由圖1 可知，與對照組相比，發酵處理后，水稻秸稈飼料中厚壁菌門相對豐度顯著提高（P＜0.05），變形菌門相對豐度顯著降低（P＜0.05）。

圖1 發酵對水稻秸稈微生物在門水平上的影響

2.4 發酵對水稻秸稈微生物在屬水平上的影響 由圖2 可知，植物乳桿菌屬、布式乳桿菌屬和檸檬乳桿菌屬是相對豐度變化排名前三的菌屬（P＜0.05），與對照組相比，發酵處理顯著提高水稻秸稈飼料中植物乳桿菌屬和檸檬乳桿菌屬的相對豐度；顯著降低布式乳桿菌相對豐度（P＜0.05）。

圖2 發酵對水稻秸稈微生物在屬水平上的影響

3 討論

水稻秸稈木質化程度較高，同時含有大量畜禽難以利用的纖維素等，飼料中直接添加過量的水稻秸稈會導致飼料適口性差，營養水平較低，最終導致畜禽生產性能下降（曾輝等，2017）。大量研究表明，使用益生菌、具有生物活性的酶制劑對水稻秸稈進行發酵處理能有效降解水稻秸稈中不易消化的粗纖維和木質纖維素，提高水稻秸稈飼料的適口性和營養水平（韓穎潔，2015）。王建兵等（2001）研究發現，聯合使用益生菌和纖維素酶對秸稈進行發酵處理，效果明顯優于單獨添加益生菌或纖維素酶，同時未觀察到明顯的拮抗作用。陶蓮等（2017）研究發現，聯合使用益生菌和木質素酶對水稻秸稈進行發酵處理，能有效降解纖維、提高蛋白和脂肪含量。本試驗結果表明，發酵處理顯著提高了水稻秸稈飼料中粗蛋白質含量，同時，畜禽難以消化吸收的纖維成分含量顯著下降。表明對水稻秸稈進行發酵處理能有效提高其營養水平，降低不易消化的纖維成分。

發酵是指在適宜的厭氧環境下向秸稈中接種益生菌和具有生物活性的酶制劑，在益生菌和酶的作用下促進益生菌增殖，抑制有害菌生長，同時降解秸稈中的纖維成分，提高其營養水平和適口性（曾輝等，2017）。因此，研究發酵飼料中的微生物多樣性及其群落結構具有重要意義（何家俊等，2023）。α 多樣性能直觀反映樣本中微生物群落豐度變化，其中Observed species 和Shannon指數分別代表觀察到的OUT 數和分類數，其數值與樣本中微生物多樣性呈正相關；Ace 和Chao1指數分別代表樣本中的OUT 數量和各樣本物種數。何家俊等（2023）研究發現，使用纖維素酶對玉米秸稈和酒糟混合青貯發酵處理后，Observed species、Shannon、Chao 1 和Ace 指數顯著提高，但對Simpson 指數無顯著影響。Zhao 等（2021）研究發現，使用纖維素酶對玉米秸稈進行發酵處理后，其飼料樣品中的Shannon 和Simpson 指數顯著升高，表明提高了微生物多樣性。本試驗結果表明，發酵水稻秸稈樣品中Observed species、Shannon、Chao 1 和Ace 指數顯著高于對照組。表明聯合使用益生菌和酶制劑對水稻秸稈進行發酵處理可顯著提高發酵水稻秸稈微生物群落多樣性。

發酵飼料中微生物組成與發酵飼料品質聯系密切。本試驗結果表明，厚壁菌門和變形菌門是檢測相對豐度最高的兩種菌門，累積占各樣本微生物菌群豐度的90% 以上，這與何家俊等（2023）的研究結果一致。有研究指出，乳桿菌屬是厚壁菌門中最重要的菌屬，對發酵飼料品質至關重要，而包括大腸桿菌等革蘭氏陰性菌在內的變形菌門則被認為對發酵飼料品質有負面影響。何家俊等（2023）在玉米秸稈上的研究發現，發酵處理后，玉米秸稈發酵飼料中后壁菌門的相對豐度顯著提高，而變形菌門的相對豐度顯著下調，這與本試驗結果基本一致，表明隨著發酵時間的延長，后壁菌門菌種大量增殖，成為優勢菌種，而變形菌門菌種的生長受到抑制。此外，屬水平上的結果表明，植物乳桿菌屬、檸檬酸菌屬和布式乳桿菌屬是相對豐度變化排名前三的菌屬，這與我們檢測到的發酵水稻秸稈中后壁菌門相對豐度顯著提高一致。有研究認為，布式乳桿菌作為異型發酵乳酸菌，其產乳酸的效率較低，而植物乳桿菌能快速產生乳酸（胡宗福，2021）。所以推測發酵處理可能通過增加植物乳桿菌相對豐度提高發酵水稻秸稈飼料品質。

4 結論

本試驗結果表明，聯合使用益生菌、纖維素酶和木聚糖酶能有效降解水稻秸稈發酵飼料纖維含量，提高營養水平，同時可以增加水稻秸稈發酵飼料中微生物群落多樣性，提高植物乳桿菌相對豐度。