快速免疫熒光染色技術在肺部感染性疾病中的應用

景竹春 陳寧 羅煥超

【摘要】? 目的? ? 探討快速免疫熒光染色技術在肺部炎癥性病變病原體鑒別診斷中的應用價值。方法? ? 對明確病原微生物類型的30例肺部感染性疾病患者的臨床病理資料進行回顧性分析，并結合文獻復習。結果? ? 30份支氣管肺泡灌洗液標本中，放線菌5例，肺炎鏈球菌2例，念珠菌8例，曲霉菌4例，毛霉菌8例，隱球菌1例，抗酸分枝桿菌2例。鏡下形態：放線菌呈放射狀，硫磺顆粒樣；肺炎鏈球菌，呈雙球菌，矛頭狀，可表現為單個或短鏈狀；念珠菌為有隔且分枝不規則的假菌絲，厚膜孢子是其特征；曲霉菌絲呈有隔且有45°分枝狀，分生孢子頭是其特征；毛霉菌菌絲呈無隔或少隔且有90°分枝狀，球形孢子囊是其特征；抗酸分枝桿菌，特征是抗酸性，細菌形態呈金黃色，細長，略彎曲狀。結論? ? 快速免疫熒光染色檢測技術能快速準確區分病原微生物種類，在肺部炎性疾病的精準治療及早期治療中均有一定的應用價值。

【關鍵詞】? 肺部炎癥性疾病；快速免疫熒光染色；真菌；菌絲

中圖分類號：R446.51? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）11-0101-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.11.034

肺部感染性疾病主要病原微生物有細菌、病毒或真菌，對慢性感染的炎性疾病，特別是缺乏特異的臨床表現而且在影像學上表現為腫塊的肺部疾病，明確病因，及時治療，對改善預后尤為重要。本文探討了免疫熒光染色檢測技術在明確肺部感染性疾病病原微生物中的應用價值。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 材料? ? 2021年9月—2022年5月期間就診于北京市第一中西醫結合醫院呼吸內科的肺部感染性疾病患者30例，臨床表現為非急性感染，影像學上顯示肺部腫塊，留取支氣管肺泡灌洗液并送檢，病理診斷報告中明確給出微生物分類。

1.2? ? 儀器與試劑? ? Nikon 80i普通顯微鏡、熒光模塊、免疫顯色試劑Ⅰ型、組織細胞熒光染色試劑和拭子均購于江蘇諾鬲生物科技有限公司，載玻片和蓋玻片購于廣鑫生物工程公司。

1.3? ? 方法

1.3.1? ? 制片? ? 將新鮮的支氣管肺泡灌洗液標本使用離心機3 000 r/ min離心5 min后，取出倒掉上清液，用棉拭子蘸取試管底部富集物沉渣的細胞，在載玻片下1/3處涂抹，采用旋轉推動形成同心圓狀的細胞層，將制好的玻璃片置于烤片機上烤2 min。一共制3張玻璃片備用。

1.3.2? ? 染色? ? 細菌染色方法：取1張載玻片，采用滴染的方法，滴加1滴紫紅色的免疫顯色試劑Ⅰ型試劑于玻璃片的細胞層上，輕微晃動，保證試劑與樣品充分混合，染色持續30 s，用蓋玻片封片。

組織細胞染色方法：取第2張玻片，選組織細胞熒光染色試劑A液，滴加1滴，晃動使染色液淹沒整個樣本，持續30 s后傾倒，然后選組織細胞熒光染色試劑B液，滴加1滴，染色30 s后傾倒，用蓋玻片封片。

抗酸分枝桿菌染色方法：取第3張載玻片，選抗酸分枝桿菌熒光染液A液，滴加一滴，染色15 min后傾倒，用滴管沖洗，然后選用抗酸分枝桿菌熒光染液B液（脫色液），滴加一滴，1 min后用純水清洗，蓋玻片封片。

1.3.3? ? 鏡下觀察? ? B波段用于觀察細菌，細菌呈桔黃色。U/V波段用于觀察真菌和抗酸分枝桿菌，真菌的菌絲和孢子呈略透亮的淡藍色，抗酸分枝桿菌呈桔黃色或金黃色。

2? ? 結果

2.1? ? 微生物分類? ? 30份支氣管肺泡灌洗液標本中，放線菌5例，肺炎鏈球菌2例，念珠菌8例，曲霉菌4例，毛霉菌8例，新型隱球菌1例，抗酸分枝桿菌2例。

2.2? ? 熒光顯微鏡下形態學結果? ? 放線菌：呈分枝狀的無隔菌絲，排列形成放射狀，菌絲末端膨大，硫磺顆粒樣；肺炎鏈球菌：雙球菌，矛頭狀，菌體寬端相對，尖端向外，多成雙排列，也可單個或短鏈狀；念珠菌：菌體呈圓形或橢圓形，藕節狀有橫隔的假菌絲，菌絲較細，分枝不規則，菌絲中間或頂端可見厚膜孢子，厚膜孢子是其特征（見封三圖1、圖2）；曲霉菌：菌體呈圓形，有隔菌絲，菌絲可分枝，呈45°或呈鈍角，可見其特征性的菊花樣的分生孢子頭（見封三圖3、圖4）；毛霉菌：是一種結合菌，菌體呈圓形，多為無隔菌絲，菌絲比曲霉菌和念珠菌粗大，可見分枝，呈90°或鈍角，較粗的菌絲梗上可見球形孢子囊（見封三圖5、圖6）；抗酸分枝桿菌：菌體呈金黃色、細長、略彎曲、單個、分枝狀（見封三圖7）；隱球菌：菌體為圓形或橢圓形，外周有一層肥厚的莢膜，鏡下似空暈，厚度是菌體的1～3倍（見封三圖8）。

3? ? 討論

快速現場細胞學評估（rapid on site evolution，ROSE）技術是運用細胞學的快速診斷特點，將現場所取得的標本制片后鏡下觀察，形成診斷意見。近幾年來，由于各種微創技術，如支氣管鏡技術、經支氣管鏡超聲技術、電磁導航支氣管鏡技術等的飛速發展，快速現場細胞學評估技術又重新回歸到臨床，成為介入呼吸病學的主要技術之一。ROSE技術主要包括兩大部分：快速現場細胞學評價（C-ROSE），快速現場微生物學評價（M-ROSE）。目前，C-ROSE技術應用比較廣泛，主要臨床應用是指導肺部疾病的診斷，評估肺部疾病的治療效果，判斷介入呼吸道疾病的治療效果，指導中央型肺癌患者治療后的隨訪。快速現場微生物學評價（M-ROSE）也有相當重要的意義，如提供病原微生物的形態學意見，同一部位可多次重復取樣并送檢，還可對療效進行評估[1]。有研究表明，現場細胞學評估在肺穿剌活檢中能指導醫生取材，提高活檢成功率[2]；在CT引導下肺穿刺結合現場細胞學評估技術，診斷準確率達89.66%[3]；現場細胞學評估聯合超聲支氣管鏡技術，對腫大淋巴結或病灶穿剌獲取的針吸細胞學標本評估，發現細胞學可疑查見惡性腫瘤細胞的陽性率為78.8%，作為金標準的組織學活檢確診惡性腫瘤陽性率為66.7%，二者相比無統計學差異。二者聯合能減少穿刺數量，降低穿剌引起并發癥的發生率，縮短操作時間。細胞學標本制片后，根據需要有以下快速染色方法：改良瑞氏染色、改良乳酸染色、改良的快速巴氏染色、甲苯胺藍染色、支原體DNA霍氏熒光染色、金-羅耐酸菌熒光染色、試劑盒化快速革蘭染色等。現場細胞學的染色方法之一快速熒光染色法，主要用于真菌的檢查，能快速檢測人體樣本中的真菌細胞壁多糖，臨床上用于淺部真菌和深部真菌感染的診斷。由于M-ROSE技術良好的特異性和敏感性，需求范圍在不斷增加，如皮膚真菌疾病、耳鼻咽喉炎性疾病、肺部感染性疾病等，均需要明確微生物種類，比如，要區分細菌或真菌或抗酸分枝桿菌，明確病原體類型，才能選擇最佳的治療方案。在彌散性外耳道炎和中耳炎的病原學診斷中應用廣泛，外耳道感染中最多見的是曲霉菌，其次是毛霉菌和念珠菌，熒光顯微鏡下見典型的具有鑒別診斷意義的孢子，如曲霉菌的分生孢子頭，毛霉菌的球孢子囊，念珠菌的厚膜孢子等可對微生物進行分類。在抗酸分枝桿菌檢測方面，有學者研究發現免疫熒光染色法有較好的應用，楊江華等[4]研究發現，29例痰涂片抗酸染色結果為陰性者，重復制片用快速免疫熒光法染色后再次鏡檢，發現有15例為抗酸分枝桿菌陽性，表明免疫熒光染色法在結核分枝桿菌中能提高痰液中陰性肺結核的診斷率。劉銀萍等[5]研究結果顯示，在痰液標本抗酸分枝桿菌檢測中，快速免疫熒光染色法的檢出率為25.7%，而萋-尼染色法為13.8%，兩者比較差異顯著（P<0.05）。表明快速免疫熒光染色法能提高抗酸分支桿菌的陽性檢出率。現場微生物學評估不僅在呼吸病學中有良好的應用價值，在甲狀腺疾病、尿路惡性腫瘤診斷、陰道分泌物病原體檢測及胃黏膜活檢中也得到了重視。尹小毛等對39例陰道炎性疾病的病原體檢測研究中發現[6]，用濕片法和免疫熒光染色法對比，前者檢出線索細胞（加德納菌感染）15例，后者檢出9例，差異無統計學意義（P>0.05）；兩種方法在念珠菌檢測中的檢出率分別為38.46%和35.9%，差異無統計學意義（P>0.05）。說明在陰道炎的病原微生物加德納菌和念珠菌的檢查中，可以應用快速免疫熒光法。

目前，肺部疾病通常是經影像學檢查發現，腫瘤及肺炎占60.0%[7]。腫瘤及肺炎性病變的影像學表現相似，明確性質對治療方案選擇很重要。肺部疾病的細胞學診斷在整體細胞學診斷中占有重要的地位，根據獲取標本的方法不同，主要分兩類。一類為脫落細胞學標本，包括痰液、胸水、心包積液、支氣管鏡刷檢、支氣管灌洗和支氣管肺泡灌洗液，另一類為細針穿刺標本。細胞病理學檢查，不僅能明確疾病是腫瘤還是炎癥，在炎癥性疾病的診斷中也有重要作用，尤其是鑒別化膿性感染如肺炎鏈球菌和特異性感染疾病如結核及常見真菌感染等。病原微生物主要分非細胞型微生物，如病毒；原核細胞型微生物，如細菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、放線菌；真核細胞型微生物，如真菌。細菌是原核生物界的一種單細胞微生物，按外形分球菌、桿菌、螺形菌，球菌分為葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、奈瑟菌屬。分枝桿菌屬分為結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、非結核分枝桿菌，分枝桿菌屬的共同特點是細胞壁中含有大量脂質，細菌難以被一般染料染色，需用助染劑并加溫使之著色，著色后又不宜以含有3%鹽酸的乙醇脫色，故也稱抗酸桿菌。真菌按形態結構分為單細胞真菌和多細胞真菌。單細胞真菌，圓形或卵圓形，如酵母型和類酵母型真菌，酵母型真菌不產生菌絲，由母細胞以芽生方式繁殖；類酵母型真菌母細胞以芽生方式繁殖出芽，產生的芽生孢子持續延長，但不斷裂不與母細胞脫離，產生相互連接成藕節狀較長的細胞鏈，稱假菌絲[8]。多細胞真菌包括曲霉菌、毛霉菌、新型隱球菌等。病原微生物感染后要用抗生素治療，不同種類的微生物有不同的敏感藥物。鏈球菌引起的炎癥可選用青霉素G，新型隱球菌感染可以兩性霉素B與氟胞嘧啶聯合用藥，念珠菌的全身用藥主要是兩性霉素B、酮康唑、米卡芬凈，曲霉菌病治療主要是兩性霉素B與曲康唑[9]，因此明確病原微生物種類可以指導臨床用藥。

熒光素標記抗體直接與病原體結合后顯色，具備免疫學和形態學的雙重優點，熒光顯微鏡下形態觀察，可區分細菌與真菌。本研究中發現的細菌有放線菌，放線菌正常寄居在人和動物的口腔、上呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道，對人類致病性較強的是衣氏放線菌，可引起內源性感染。肺部放線菌多發生于農村，常見于免疫功能低下者。放線菌呈絲狀，常形成無隔菌絲，需要與真菌鑒別。另外，由于放線菌具有弱抗酸性，需與抗酸分枝桿菌鑒別。實際工作中，延長鹽酸酒精脫色時間，使放線菌變為抗酸陰性。抗酸分枝桿菌在本研究中也發現2例，熒光染色后顯金黃色。需要注意的是，結核分枝桿菌易通過飛沫傳播，標本制片過程中需要滅活。有兩種方法：（1）結核分枝桿菌在75%乙醇內數分鐘即死亡，因此可在制片后放入5 min來滅菌，（2）結核分枝桿菌對熱敏感，可通過加熱方法滅菌。肺細菌感染中肺炎鏈球菌常見，其寄居于正常人的鼻咽腔中，多數不致病，僅少數有致病力。肺炎鏈球菌與A群鏈球菌形態上都是球菌，兩者的鑒別點主要是：A群鏈球菌由球形或橢圓形的菌體連接而成，表現為長短不一的鏈狀；肺炎鏈球菌的菌體呈矛頭狀，寬端相對，尖端向外，多數表現為雙球菌，成雙排列，但在肺組織病變中可呈短鏈狀。近年來，隨著大劑量腎上腺皮質激素、細胞毒性免疫抑制劑、導管插管、器官移植化療以及介入治療等新診療技術的廣泛應用，加上長期大量濫用廣譜抗生素、嚴重的基礎疾病、艾滋病、糖尿病、腫瘤等易感人群的增多，念珠菌病發病率呈明顯上升趨勢。念珠菌至少有20余種可致人類疾病，廣泛存在于自然界的土壤、醫院環境、各種物品表面及水果中。同時，在人體皮膚、口腔、胃腸道和陰道等處也能分離出來。念珠菌病的臨床表現無特異性，較難與細菌感染相鑒別，可發生局部感染及深部感染，局部以皮膚、黏膜感染為主，如口腔念珠菌病、念珠菌性唇炎、念珠菌性口角、念珠菌性陰道炎、念珠菌性包皮炎；深部感染如呼吸系統念珠菌病、消化系統念珠菌病、食管和腸道感染、泌尿系念珠菌病、念珠菌菌血癥、念珠菌性心內膜炎、念珠菌性腦膜炎等，一旦發生這些深部的侵襲性念珠菌病，病死率很高，一般成人15%～25%，最高達47%，新生兒及兒童略低，大約10%～15%。念珠菌為單細胞類酵母型真菌，菌體呈圓形或卵圓形，直徑4～6μm，芽生方式繁殖，細菌體能發育伸長成細絲狀的假菌絲，有橫隔，不規則的分枝，可見芽生孢子和厚膜孢子，厚膜孢子是其特征之一。本文研究中發現曲霉菌引起的肺炎4例。最常見的曲霉菌是煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉，曲霉屬于絲狀真菌，是條件性致病真菌，通過氣道吸入大量孢子后，如機體不能及時清除，則會導致曲霉病，主要表現為侵襲性感染和變態反應綜合征。發病原理是孢子在宿主體內發育為菌絲后，細菌體的致病因子成分得以暴露，巨噬細胞可識別這些成分并分泌炎癥介質，引發炎癥。曲霉菌可引起過敏、肺部感染、皮膚感染和肺外傳播，最常累及的部位是支氣管和肺臟，還可侵犯鼻竇和皮膚。消化系統也可受累，以肝臟受累最為多見，其次是小腸、胃、食管、舌。曲霉菌為多細胞真菌，芽管方式繁殖，菌絲有橫隔，分枝呈45°或鈍角，分生孢子梗的頂端或側面可形成分生孢子，呈菊花狀。毛霉菌病起始病灶常位于鼻腔，很快擴散到鼻竇和中樞神經系統，再擴散到肺和胃腸道。毛霉菌屬結合菌門，結合孢子，菌絲寬大，無橫隔或少橫隔，分枝呈90°或鈍角，菌絲末端形成一種囊狀結構叫球孢子囊，倒置的燒瓶狀。在肺泡灌洗液標本中發現1例新型隱球菌感染引起的肺炎。新型隱球菌是隱球菌屬中唯一致病的真菌，人體通常是通過吸入環境中氣溶膠化的新型隱球菌孢子而感染，病原體主要存在于鴿糞、水果和土壤中，但在健康人的皮膚、黏膜和糞便中也可分離出。新型隱球菌引起的深部真菌病可累及腦膜、肺、皮膚、骨骼和血液等器官和部位，隱球菌性腦膜炎為最常見的臨床類型。新型隱球菌的形態呈圓形或卵圓形，直徑為5～10 μm，外周圍繞著一層寬厚的多層莢膜，為主要的毒力因子。新型隱球菌可用免疫熒光染色方法查找，也可用墨汁涂片直接鏡檢，發現出芽的酵母樣菌，外周有透亮的厚壁莢膜。還有一種方法是用黏蛋白胭脂紅染色，酵母樣菌的莢膜呈深玫瑰紅色。本文采用免疫熒光染色法查見的新型隱球菌體為圓形或橢圓形，外周有一層肥厚的莢膜，鏡下似空暈，厚度是菌體的1～3倍，比較典型。本研究發現肺部感染性疾病中真菌主要類型是念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、新型隱球菌，沒有發現其他真菌如肺球孢子菌、組織胞漿菌、馬爾尼菲青霉菌和耶氏肺孢子菌等引起的肺炎；可能是這些真菌性肺炎多發生于免疫缺陷患者或者南方或野外工作者，該院就診的患者上述人群罕見，所以沒有發現這些類型的真菌。

真菌和細菌的檢查方法有多種，如痰培養，直接鏡檢，活檢組織切片查找。細菌培養可以出現假陽性或者假陰性，通常培養陽性率只有10%～30%。染色方法也有多種，如HE、PAS法、六胺銀染色法和快速免疫熒光染色法[10]。真菌用HE方法時，染色著色不佳；PAS和六胺銀特染可用來顯示念珠菌、新型隱球菌、曲霉菌、毛霉菌和放線菌等，效果較佳，但是網狀纖維和纖維素也被著色，在診斷中易與真菌混淆。丁如[11]的研究指出，真菌快速熒光染色法的優點是快速性、專一性、實用性、高靈敏性。肺孢子菌肺炎是耶氏肺孢子菌引起的一種機會性感染，多發生在免疫功能缺陷綜合征的人群。有研究者發現[12]，流式細胞術可用于耶氏肺孢子菌檢測，敏感性和特異性可達100%。流式細胞術是近年來發展的新技術，但是不足之處是價格高，耗時長，操作復雜，技術含量高，臨床推廣困難。在病原微生物診斷中，可聯合應用快速免疫熒光法結合PCR、流式細胞術、基因序列分析等幾種高新技術。

快速免疫熒光染色技術利用熒光素特異性標記細菌多糖抗原，形成強的熒光復合物，在熒光顯微鏡下觀察熒光形態，快速有效鑒別病變性質是腫瘤還是病原微生物感染，并且根據形態能進一步明確細菌和真菌的具體類型。本研究證明快速免疫熒光染色方法能良好地顯示細菌和真菌的形態，有較高的臨床應用價值。目前存在的問題是，病理學者對微生物學欠重視，細胞學專家更愿意致力于細胞學評估，在微生物評估中投入精力不足，對微生物學的基本知識了解不夠，判斷分析微生物形態缺少嚴密的邏輯能力。因此，在現實工作中，要提升細菌、真菌等病原菌形態學認識水平，同時結合臨床癥狀、影像學資料、流行病學史等，綜合分析作出正確的判斷。總之，相較其他檢測方法，快速免疫熒光法制片簡單，30 min內可出結果，鏡下形態特點易掌握，而且有極高的靈敏度和特異性，無假陽性，值得在基層醫院推廣應用。

參考文獻

[1]? ? 王承志，王詠梅，楊慶嬋.快速現場細胞學評估在肺穿刺活檢中的應用[J].天津醫藥，2021，49（1）：94-97.

[2]? ? 李燕燕，李凱述，王洵，等.快速現場細胞學在CT引導下經皮肺穿刺活檢肺外周結節中的應用[J].中國介入影像與治療學，2020，17（1）：18-21.

[3]? ? 庚俐莉，劉春芳，馬海英，等.現場細胞學在超聲支氣管鏡引導下支氣管針吸活檢的應用價值[J].中國腫瘤臨床與康復，2017，24（3）：292-294.

[4]? ? 楊江華，朱曉玥，王文節.免疫熒光染色法檢測結核分枝桿菌的建立與臨床應用[J].中國實驗診斷學，2015，19（5）：775-777.

[5]? ? 劉銀萍，呂尚軍，賀雄，等.兩種染色法在分枝桿菌檢測中的臨床應用價值[J].解放軍醫學雜志，2012，37（6）：669-673.

[6]? ? 尹小毛，賴少芬，馮潔儀，等.免疫熒光在陰道分泌物病原體檢測中的應用[J].檢驗醫學與臨床，2012，18（15）：2220-2222.

[7]? ? 張國楨.實用胸部CT診斷學[M].北京：科學技術文獻出版社，1994：100-102.

[8]? ? 李凡，徐志凱.醫學微生物學[M].北京：人民衛生出版社，2021：93-94.

[9]? ? 李蘭娟，任紅.傳染病學[M]. 北京：人民衛生出版社，2013：239-247.

[10]? ? 王德田，董建強.實用現代病理學技術[M].北京：中國協和醫科大學出版社，2012：134-137.

[11]? ? 丁如.臨床檢驗中免疫熒光技術的應用[J].實用醫技雜志，2013，20（12）：1325-1326．

[12]? ?BARBOSA J，BRAGADA C，COSTA DE OLIVEIRA S，et al．A new method for the detection of Pneumocystis jirovecii using flow cytometry[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2010，29（9）：1147-1152．

（收稿日期：2023-01-26）