川芎嗪對阿爾茨海默病小鼠神經的保護作用

肖寒露 何超芹 周百桂 章娟娟

[摘要]?目的?探討川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）對阿爾茨海默病（Alzheimers?disease，AD）小鼠海馬神經組織的保護作用。方法?以C57BL/6小鼠作為對照組，APP/PS1雙轉基因小鼠作為模型組、TMP低、中、高劑量組灌胃20、40、60mg/kg?TMP，1次/d，連續30d。Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶和空間探索能力，酶聯免疫吸附法檢測小鼠海馬神經組織超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）活性、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量、腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10、β-淀粉樣蛋白（β-amyloid?protein，Aβ）1-40、Aβ1-42、β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid?precursor?protein，β-APP）含量。結果?與對照組比較，模型組內平均逃避潛伏期延長，平臺停留時間、跨平臺次數、SOD活性、GSH-Px活性降低（P<0.05），MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量上升（P<0.05）。與模型組比較，TMP低、中、高劑量組小鼠平均逃避潛伏期縮短，平臺停留時間、跨平臺次數、SOD活性、GSH-Px活性上升（P<0.05），MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量降低（P<0.05）。結論?TMP能改善AD小鼠學習記憶能力，減輕海馬神經組織氧化應激和炎癥反應，減少Aβ含量。

[關鍵詞]?川芎嗪；阿爾茨海默病；氧化應激；炎癥反應；Aβ水平

[中圖分類號]?R749.16??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.24.022

Tetramethylpyrazine?protects?neural?in?mouse?model?of?Alzheimers?disease

XIAO?Hanlu1，?HE?Chaoqin1，?ZHOU?Baigui2，?ZHANG?Juanjuan1

1.Department?of?Pharmacy，?Zhejiang?Jinhua?Guangfu?Tumor?Hospital，?Jinhua?321000，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Neurology，?Zhejiang?Jinhua?Guangfu?Tumor?Hospital，?Jinhua?321000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?protective?effect?of?tetramethylpyrazine?（TMP）?on?hippocampal?neural?tissue?in?Alzheimers?disease?（AD）?mice.?Methods?The?C57BL/6?mice?were?used?as?the?control?group，?the?APP/PS1?double?transgenic?mice?were?used?as?the?model?group，?and?the?TMP?low，?medium?and?high?dose?groups?were?given?intragastric?administration?of?20，?40，?and?60mg/kg?of?TMP，?once?a?day?for?30?consecutive?days.?Morris?water?maze?test?was?used?to?detect?the?learning?and?memory?and?space?exploration?ability?of?mice.?Enzyme-linked?immunosorbent?assay?was?used?to?detect?superoxide?dismutase?（SOD）?activity，?glutathione?peroxidase?（GSH-Px）?activity，?malonaldehyde?（MDA）?content，?tumor?necrosis?factor-α?（TNF-α），?interleukin?（IL-）-1β，?IL-10，?β-amyloid?protein?（Aβ）1-40，?Aβ1-42，?β-amyloid?precursor?protein?（β-APP）?content?in?mouse?hippocampal?nerve?tissue.?Results?Compared?with?the?control?group，?the?escape?latency?of?the?mice?in?the?model?group?was?prolonged，?and?the?platform?residence?time，?the?times?of?cross-platforms，?SOD?activity，?and?GSH-Px?activity?were?reduced?（P<0.05），?MDA?content，?TNF-α，?IL-1β，?IL-10，?Aβ1-40，?Aβ1-42，?β-APP?content?were?increased?（P<0.05）.?Compared?with?the?model?group，?the?escape?latency?of?mice?in?the?low，?medium，?and?high?dose?groups?of?TMP?was?shortened，?and?the?platform?residence?time，?cross-platform?times，?SOD?activity，?and?GSH-Px?activity?were?increased?（P<0.05），?MDA?content，?TNF-α，?IL-1β，?IL-10，?Aβ1-40，?Aβ1-42，?β-APP?content?increased?（P<0.05）.?Conclusion?TMP?can?improve?the?learning?and?memory?ability?of?AD?mice，?reduce?the?oxidative?stress?and?inflammation?of?hippocampal?nerve?tissue，?and?reduce?the?content?of?Aβ.

[Key?words]?Tetramethylpyrazine;?Alzheimers?disease;?Oxidative?stress;?Inflammatory?response;?Aβ?level

阿爾茨海默病（Alzheimers?disease，AD）是一種起病隱匿的中樞神經系統疾病，臨床癥狀主要為認知障礙、執行能力障礙、失語等[1]。AD的主要病理特征包括細胞外間隙β-淀粉樣蛋白（β-amyloid?protein，Aβ）沉積形成的老年斑、異常磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神經原纖維纏結、神經炎癥、神經元突觸丟失和線粒體損傷[2]。因此AD可通過改善認知功能、清除氧化自由基、提高活性氧表達、抑制炎癥因子分泌、減少Aβ形成及沉積等多種途徑防治AD的發展[3]。β淀粉樣蛋白毒性學說對AD的發病、發展起到重要作用，也是AD發病的中心環節[4]。

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是一種鈣拮抗劑，從中藥材川芎中提取的主要活性物質之一，具有抗氧化、抗炎、降血栓、抗凋亡、抗纖維化和抗腫瘤等作用，且在神經退行性疾病AD、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側索硬化和多發性硬化及心腦血管疾病中起重要作用[5]。已有研究證明，TMP對AD具有良好的治療作用，能夠減輕AD小鼠神經元凋亡、氧化損傷和炎癥損傷，減少AD功能障礙[6]。但TMP對APP/PS1雙轉基因小鼠的研究機制尚不清楚。本研究以APP/PS1雙轉基因小鼠為研究對象，探討TMP對AD模型小鼠海馬神經組織保護和Aβ水平作用及其相關機制，旨在為AD的研究提供實驗依據。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??主要試劑??TMP（濃度≥98%，批準文號：國藥準字H20057041，生產單位：江蘇永健醫藥，規格：2ml∶40mg）；超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）檢測試劑盒、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Aβ1-40、Aβ1-42、β-淀粉樣前體蛋白（beta-amyloid?precursor?protein，β-APP）檢測試劑盒（上海一研生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic?acid，BCA）試劑盒、顯色劑（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2??實驗動物??5月齡SPF級APP/PS1雙轉基因小鼠40只，實驗動物合格證號：SCXK（京）2014-0004。同月齡C57BL/6小鼠10只（北京華阜康生物科技股份有限公司）。實驗動物飼養于本實驗室，自由飲水、進食，室溫23～26℃，濕度50%～70%。所有小鼠適應1周后進行實驗，本研究經浙江金華廣福腫瘤醫院倫理委員會批準（倫理審批號：20-085）。

1.2??方法

1.2.1??小鼠的分組及處理??C57BL/6小鼠作為對照組，APP/PS1雙轉基因鼠分為模型組、TMP低、中和高劑量組，分別灌胃20、40、60mg/kg?TMP，對照組和模型組灌胃0.2ml生理鹽水，1次/d，連續30d。

1.2.2??Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力??給藥30d后，開始進行Morris水迷宮實驗。實驗5d完成，從第1天開始訓練小鼠，訓練時將小鼠頭部面向池壁放入水內，記錄小鼠找到平臺的時間即為逃避潛伏期，90s內小鼠未找到平臺，可直接將小鼠引至平臺。第5天定位實驗結束后，將平臺撤出，在標記的特定位置將小鼠放入水中，觀察小鼠90s內在原平臺停留時間、跨平臺次數。

1.2.3??ELISA檢測海馬神經組織SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量??將海馬神經組織剪碎，加入磷酸鹽緩沖液，4℃?12000轉/min離心5min收集上清液，按照酶聯免疫吸附實驗檢測試劑盒說明書步驟進行，采用酶標儀檢測對應波長處的光密度值，并依據相應的標準曲線計算MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP。

1.3??統計學方法

采用SPSS?20.0統計學軟件對數據進行處理及分析，計量資料均符合正態分布并以均數±標準差（）表示，兩兩比較采用t檢驗。計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??TMP對AD小鼠逃避潛伏期的影響

與對照組比較，模型組平均逃避潛伏期延長（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組平均逃避潛伏期均縮短（P<0.05），5組小鼠運動距離、平均速度比較，差異無統計學意義（P>0.05），見圖1。

2.2??TMP對AD小鼠空間探索能力的影響

與對照組比較，模型組平臺停留時間、跨平臺次數降低（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組平臺停留時間、跨平臺次數均增加（P<0.05），見圖2。

2.3??TMP對AD小鼠海馬神經組織氧化應激的影響

與對照組比較，模型組海馬神經組織中SOD活性、GSH-Px活性顯著降低（P<0.05），MDA含量增加（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組海馬神經組織中SOD活性、GSH-Px活性均顯著增加（P<0.05），MDA含量均降低（P<0.05），見圖3。

2.4??TMP對AD小鼠海馬神經組織炎癥反應的影響

與對照組比較，模型組海馬神經組織TNF-α、IL-1β、IL-10含量增加（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組海馬神經組織TNF-α、IL-1β、IL-10含量均降低（P<0.05），見圖4。

2.5??TMP對AD小鼠海馬神經組織中Aβ含量的影響

與對照組比較，模型組海馬神經組織Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量增加（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組海馬神經組織Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量均降低（P<0.05），見圖5。

3??討論

AD是一種廣泛、進行性、不可逆及破壞性的神經退行性疾病，是導致癡呆的主要原因，血管疾病、吸煙、高血壓、糖尿病、高胰島素血癥和神經炎癥被證實會增加患臨床AD的風險[1]。AD的病因尚不明確，主要有氧化應激學說、Aβ毒性學說、神經凋亡學說及基因突變學說，其中Aβ毒性學說是主流學說[7]。

Morris水迷宮實驗廣泛用于學習記憶、老年癡呆、神經生物學、動物心理學等多個領域，可用來研究動物的空間記憶和學習能力，在驗證神經認知障礙的嚙齒動物模型中發揮重要作用[8]。氧化應激是神經退行性疾病包括AD的主要病理過程，AD患者氧化應激相關的活性氧過量產生導致膜損傷、細胞骨架改變和細胞死亡，對大腦中的脂質和蛋白質造成不利影響，影響認知和大腦功能[9]。MDA是ROS造成生物膜脂質氧化過程中產生的，是氧化應激生物標志物，能夠反映機體脂質過氧化強度和速率，可以間接反應氧化損傷程度；SOD、GSH-Px是清除自由基抗氧化物的關鍵酶，能夠保護機體氧化自由基免受損傷，因此SOD和GSH-Px活性可反映清除自由基能力，作為檢測氧化應激的生物學指標[10]。炎癥反應是人體的一種防御機制，是抵抗損傷和感染的重要生理和病理過程，在各種神經系統疾病包括AD中炎癥反應起重要作用。在AD人類和動物腦組織周圍炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-10過度釋放，引起神經組織炎癥浸潤，導致中樞神經系統炎癥損傷[11]。本研究結果顯示，模型組小鼠平均逃避潛伏期延長，而小鼠平臺停留時間、跨平臺次數降低，神經組織內SOD活性、GSH-Px活性降低，促進MDA含量，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10含量分泌增加，提示AD模型構建成功。

中醫藥在預防和治療AD方面，具有毒性低、易于穿越血–腦脊液屏障和多種協同作用等優點。中藥川芎含有多種活性，臨床多用于治療心腦血管、腎臟等疾病，TMP是天然藥物川芎生物堿類化合物。現代藥理實驗表明，其具有抗腫瘤、鎮痛、抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡、調節自噬、心血管保護和神經保護等作用[12]。TMP對神經疾病有很好的保護作用。Michel等[13]研究發現TMP可減輕魚藤酮誘導的PD大鼠神經生物學和行為缺陷且具有抗凋亡、抗炎和抗氧化作用。Lu等[14]研究發現TMP對甲基苯基四氫吡啶誘導的PD大鼠多巴胺能神經元有神經保護作用。TMP與AD發病機制有關，可以通過增強線粒體生物合成、保護興奮性毒性、阻斷鈣通道和防止氧化應激誘導的神經元死亡，減少AD發生。Weng等[6]研究發現TMP可通過抑制Cullin?4B表達和生長抑素受體4泛素化降解，減輕神經元凋亡和損傷，提高AD小鼠的認知能力；Zhang等[15]研究發現TMP治療可顯著減弱同型半胱氨酸誘導的Tau過度磷酸化和Aβ積累，對AD大鼠的神經病變有保護作用。本研究結果顯示，TMP能改善AD模型小鼠的學習記憶能力，減輕海馬神經組織氧化應激和炎癥，與文獻研究結果相似，為TMP在AD治療提供新的途徑[5-13]。

Aβ毒性學說認為是由于人腦皮質和邊緣區域中Aβ斑塊的細胞外聚集和由過度磷酸化的τ蛋白構成的細胞內NFT，導致神經細胞凋亡，誘導氧化應激，激活小膠質細胞誘導中樞神經系統炎癥，誘導神經元鈣離子穩態失衡，降低細胞膜流動性，引發中樞神經系統產生退行性病變[16]。而Aβ聚集的發生是由于APP被β-分泌酶和γ-分泌酶的差異切割，導致細胞外Aβ1-40和Aβ1-42的釋放產生不溶性Aβ原纖維，纖維聚集成斑塊導致激酶激活，從而引起微管相關蛋白過度磷酸化，最終聚合成不溶性NFT[17]。斑塊和纏結致使周圍的小膠質細胞募集，誘發小膠質細胞活化和局部炎癥，并發展為神經毒性。Aβ誘導的神經元損傷是多維度、多機制的，在AD腦組織內，Aβ大量累積，易發生纖維化，產生大量的ROS，破壞神經細胞元內部環境，對神經元細胞產生毒性作用，造成神經元調亡，導致突觸受損，出現認知功能障礙和認知缺陷[18]。TMP作為潛在的抗氧化劑可抑制自身誘導的Aβ聚集，Weng等[6]發現TMP在減輕AD認知障礙的同時降低Aβ水平和Tau磷酸化；劉長安等[19]研究發現TMP能有效抑制AD大鼠神經元ROS生成，抑制炎癥因子釋放，改善炎癥，降低Aβ的神經毒性，對AD大鼠起神經保護作用；Zhang等[20]發現TMP類似物T-006通過抑制AD病轉基因小鼠中Tau表達和磷酸化來緩解認知缺陷。本研究結果顯示，模型組內Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP過量累積，經過TMP灌胃APP/PS1雙轉基因小鼠，Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量降低，說明TMP能減少AD模型小鼠海馬內Aβ生成，與上述文獻結果類似。

綜上所述，TMP能改善AD模型小鼠的學習記憶能力，減少神經組織氧化應激、炎癥反應和Aβ生成，起到保護神經的作用。

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（收稿日期：2022–08–31）

（修回日期：2023–07–28）